早發(fā)2型糖尿病家系mody1-5基因突變的直接測序

早發(fā)2型糖尿病家系mody1-5基因突變的直接測序

青少年成人疾?。╤m）是一組高度遺傳和臨床表型異質(zhì)的糖尿病亞型。這是由于單基因遺傳缺陷。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了六種與莫霍尼韋爾相關(guān)的基因：莫霍尼韋爾-4（hnf-4）、莫基耶爾-2葡萄糖激酶（glck）、莫洛西亞和美沙丁1（hnf-1）、莫洛西亞和美沙丁1（ipf1）、莫洛西亞和美沙丁1（hnf-1）、莫洛西亞和美沙丁1（neuro1，貝基）。通過基因?qū)W分析確定突變是目前研究MODY的主要手段,國外和我國香港學(xué)者對有家族史的早發(fā)2型糖尿病家系(<40歲)進(jìn)行基因篩查,發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)比例的家系存在MODY基因的突變。本試驗(yàn)擬通過對早發(fā)2型糖尿病家系先證者進(jìn)行MODY1-5基因直接測序,尋找中國人中可能存在的MODY基因突變。1材料和方法1.1糖尿病史研究發(fā)現(xiàn)從廣東省糖尿病中心患者資料庫中(2000年至2005年收集)選取同時(shí)符合以下兩個(gè)條件的19個(gè)早發(fā)2型糖尿病家系:(1)3代糖尿病家族史或2代糖尿病家族史且同一輩中有3個(gè)或以上糖尿病患者(祖輩代已逝但有明確糖尿病史者包括在內(nèi));(2)家族中有1個(gè)或以上患者在35歲以前發(fā)病。糖尿病的診斷按照世界衛(wèi)生組織(WHO)1999年糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。19個(gè)家系中,15個(gè)家系為3代糖尿病家族史,4個(gè)家系為兩代糖尿病家族史且同一輩中有3個(gè)或以上糖尿病患者。先證者發(fā)病年齡是(35±12)歲(范圍15~53歲),BMI為(24.7±3.8)kg/m2(范圍17.4~32.2kg/m2),空腹C肽為(0.45±0.23)pmol/mL(0.16~0.87pmol/mL),GAD均陰性,無酮癥傾向。1.2學(xué)習(xí)方法1.2.1取血清中的dna，用苯酚氯仿法提取血清中的dna1.2.2查前是否需要排除線粒體糖尿病亦是患病率較高的單基因突變糖尿病,在進(jìn)行MODY篩查前,需要先對其進(jìn)行排除。我們采用聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)(PCR-RFLP)法,首先進(jìn)行線粒體基因tRNALEU(UUR)3243A→G位點(diǎn)的檢測,19個(gè)先證者中未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突變。1.2.3基于ade-pcr擴(kuò)增的taqna以19個(gè)家系先證者外周血DNA為模板,采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),擴(kuò)增MODY1-5基因(包括啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子區(qū)、外顯子及其相鄰拼接區(qū))。MODY4基因的2個(gè)外顯子擴(kuò)增使用TAKARA公司的LATaqTMDNA聚合酶,其他擴(kuò)增片段均選用AmpliTaqDNA聚合酶。熱循環(huán)計(jì)劃為預(yù)變性94℃4min;變性94℃30s,54~64℃退火30s,延伸72℃40s,共30個(gè)循環(huán);最后終末延伸72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色后紫外線下觀察。1.2.4遺傳分析方法熒光標(biāo)記純化后的PCR產(chǎn)物并在ABI3100-Avant型遺傳分析儀上樣測序(500bp以上或富含GC的片段用377遺傳分析儀)。測序結(jié)果與PubmedGenebank上公布的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較分析,從而判定變異的位點(diǎn)及編碼氨基酸序列的變化。2家系中糖尿病的發(fā)生率19個(gè)家系先證者未發(fā)現(xiàn)MODY基因突變,但發(fā)現(xiàn)多種多態(tài)性(表1),分別是MODY1基因6種,MODY2基因5種,MODY3基因15種,MODY4基因1種,MODY5基因1種變異,均為國內(nèi)外報(bào)道過的多態(tài)性。我們對本研究的19個(gè)家系先證者的臨床表型進(jìn)行進(jìn)一步分析,并將其與文獻(xiàn)中提及的MODY-X進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)這些家系有相似之處,如發(fā)病年齡較晚,BMI相近,血脂水平相當(dāng)(表2)。在19個(gè)家系中,有1個(gè)家系(CAO,家系圖1)的顯性糖尿病的發(fā)生率極高,尤其是第2代幾乎全受累。該家系初診時(shí)共檢查了3代共20人,第2代10人中有8人確診為糖尿病,1人為糖耐量異常(Ⅱ8),1人拒絕檢查(Ⅱ9),第3代9人中有3人患糖尿病,1人為糖耐量異常。1年后隨訪,第2代的Ⅱ8和Ⅱ9均進(jìn)展為糖尿病,這個(gè)高度外顯的家系的診斷年齡為(47.8±14.0)歲。3討論3.1gck基因突變MODY廣泛分布于歐洲、拉丁美洲、非洲及亞洲等人群,其中MODY2、MODY3比率最高,分別占全部MODY家系的7%~63%,11.5%~73%,尤其是歐洲白種人MODY家系,高達(dá)50%以上均為GCK及HNF-1α基因突變所致。而日本及我國香港的研究人群中,MODY的發(fā)生率則遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于歐洲白人。中國香港145例早發(fā)糖尿病患者中,僅有4%為MODY2,5%為MODY3。中國大陸地區(qū)自上個(gè)世紀(jì)90年代才開始MODY的研究,最早由項(xiàng)坤三等對30例45歲或以前發(fā)病伴糖尿病家族史的中國人進(jìn)行GCK基因突變的掃查,但未發(fā)現(xiàn)突變。近年,北京、上海報(bào)道了各自MODY篩查的結(jié)果,只有上海發(fā)現(xiàn)一例MODY5。本研究對19例早發(fā)2型糖尿病家系檢測MODY1-5基因,未發(fā)現(xiàn)突變。位于MODY3基因(HNF-1α)啟動(dòng)子區(qū)的-302C>T變異曾由Lehto等在115例有明顯家族史的早發(fā)型糖尿病家系先證者中發(fā)現(xiàn)了1例,但在92例正常對照者中未發(fā)現(xiàn),即該變異極少見。我們對具有啟動(dòng)子區(qū)-302C>T變異的一個(gè)家系進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果顯示,該變異與糖尿病并非共分離。故啟動(dòng)子區(qū)-302C>T變異是一少見的多態(tài)性。MODY3基因(GCK)IVSnt1bnt+12A>T變異發(fā)生在肝臟特異性1b的內(nèi)含子區(qū),既往學(xué)者發(fā)現(xiàn)在中國人的2型糖尿病者尤其是起病早及伴有明顯糖尿病家族史中,可伴該變異,但未見于正常糖耐量者。我們對該家系進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)先證者的變異基因來自其患糖尿病的母親,而糖耐量正常的父親和妹妹不帶有該變異。由于該變異位于內(nèi)含子區(qū),且并非剪接位點(diǎn),一般位于內(nèi)含子區(qū)的堿基替換不會(huì)影響基因表達(dá),故我們認(rèn)為,該變異是一種少見的多態(tài)性。以上結(jié)果提示MODY基因突變的分布在不同種群中存在較大異質(zhì)性。這些差異可能是在漫長的進(jìn)化過程中,自然選擇對某些基因位點(diǎn)所起的作用不同,從而導(dǎo)致基因突變分布頻率的地域性差異。此外,近年有研究顯示MODY基因的多態(tài)性增加了2型糖尿病發(fā)生的危險(xiǎn)(如HNF-1αI27L),本研究在19個(gè)家系先證者中發(fā)現(xiàn)多種多態(tài)性,這些多態(tài)性很可能參與了家族中糖尿病的發(fā)生。3.2患者臨床特征檢測,主要有外源性胰島素治療或臨床對于較高bmi較難研究發(fā)現(xiàn),相當(dāng)比例表現(xiàn)為單基因遺傳的家系(即使是符合MODY診斷標(biāo)準(zhǔn)),雖有部分系線粒體基因或MODY基因突變所致,但仍有相當(dāng)比例家系的致病基因未明。這些家系(MODYgenenegative,許多研究稱其為MODY-X)表現(xiàn)出明顯的家族聚集性和糖尿病的早發(fā),進(jìn)一步分析其臨床特征,發(fā)現(xiàn)與MODY患者相比較,其診斷年齡稍晚,BMI較高,并具有胰島素抵抗的某些特征(相對高的甘油三酯和胰島素水平,相同C肽情況下需更多外源性胰島素治療)。即這些MODY-X家系并不具有典型的MODY的特點(diǎn),而是更傾向于傳統(tǒng)的2型糖尿病,由于其遺傳模式上表現(xiàn)為孟德爾遺傳,故推測其可能是早發(fā)的單基因遺傳的2型糖尿病,也許存在主效基因參與發(fā)病。本研究對19個(gè)早發(fā)型糖尿病家系先證者的臨床表型進(jìn)行分析,顯示了相對大的診斷年齡、BMI和相對高的血脂水平