流式細(xì)胞分選法制備單核細(xì)胞

流式細(xì)胞分選法制備單核細(xì)胞

mcrophone可以吞咽起來的異體感染，誘導(dǎo)t細(xì)胞激活并啟動(dòng)免疫反應(yīng)。這在組織損傷修復(fù)和防止病原體入侵方面發(fā)揮著重要作用。這是身體提前免疫的重要組成部分。巨噬細(xì)胞屬于無顆粒白細(xì)胞的一種,是由單核細(xì)胞(Monocyte)分化而來的。單核細(xì)胞來源于骨髓,成熟后釋放進(jìn)入血液并隨外周血循環(huán)進(jìn)入組織,分化成為巨噬細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)的功能。研究者可以對(duì)人外周血進(jìn)行分離,獲取單核細(xì)胞后進(jìn)行體外分化,分化得到的巨噬細(xì)胞可用于進(jìn)行各種功能研究。目前常用的獲取人外周血單核細(xì)胞的方法是密度梯度離心法。基于Ficoll-Hypaque的單次密度梯度離心可以將紅細(xì)胞,粒細(xì)胞,血小板以及單個(gè)核細(xì)胞逐層分開。其中,外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞,進(jìn)一步對(duì)PBMC離心清洗并用貼壁方法去除懸浮細(xì)胞后,可得到單核細(xì)胞。但該方法對(duì)于液層吸取操作要求較高,獲得的單核細(xì)胞中會(huì)存在較多淋巴細(xì)胞,粒細(xì)胞以及血小板的污染。通常的解決方法是用抗體標(biāo)記結(jié)合免疫磁珠對(duì)PBMC中的單核細(xì)胞進(jìn)行純化富集。然而不論基于抗體陰選還是陽選的方法,都不可避免對(duì)單核細(xì)胞產(chǎn)生一定程度的免疫刺激或者機(jī)械損傷;分選操作過程較長(zhǎng),在實(shí)驗(yàn)過程中要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)洗滌離心等操作,也會(huì)造成目的細(xì)胞的遺失,對(duì)于少量的臨床樣品難以操作。另外也可以選擇基于Percoll分層液的連續(xù)密度梯度離心分離法,可以直接將單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、粒細(xì)胞分層,但是操作繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng),對(duì)試劑的消耗量也比較大。因此,尋找一種簡(jiǎn)便、快捷而又高效的單核細(xì)胞分離方式對(duì)于單核-巨噬細(xì)胞相關(guān)研究的開展至關(guān)重要。單核細(xì)胞是體積最大的白細(xì)胞,其內(nèi)容物的顆粒形狀與淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞等具有顯著的差別。本文中嘗試對(duì)外周血白細(xì)胞直接進(jìn)行流式細(xì)胞分選,根據(jù)細(xì)胞組分的分群特征,直接獲得其中的單核細(xì)胞,并通過單核細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14染色進(jìn)行驗(yàn)證,該方法對(duì)于單核細(xì)胞的分選效率能達(dá)到85%以上,可以簡(jiǎn)單快捷的獲得純度較高的單核細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1材料和方法1.1cd14抗體人外周血白細(xì)胞成分血來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科。紅細(xì)胞裂解液(10×,#420301)購自Biolegend公司。人CD14抗體(130—091—242)購自MiltenyiBiotec公司。流式細(xì)胞分離管購自BD公司。人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-SCF購自R&D公司。RPMI1640培養(yǎng)液(C11875),進(jìn)口胎牛血清,購于Invitrogen公司。1.2流式緩沖液法人外周血白細(xì)胞成分血中仍含有大量紅細(xì)胞,在流式分選前需要進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理。將白細(xì)胞成分血與稀釋為1×的紅細(xì)胞裂解液按照1∶10的比例混合,避光室溫裂解15min,300g離心10min,PBS洗滌一次。細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞用流式緩沖液重懸(1×107細(xì)胞用500μL緩沖液重懸)。流式緩沖液:高壓滅菌的PBS,pH值為7.2,加入0.5%的牛血清白蛋白以及2molEDTA。1.3流式細(xì)胞分析取1×106細(xì)胞,即50μL上述細(xì)胞懸液,加入1μLCD14-PE抗體,避光冰上標(biāo)記10min,向離心管中加入1mL流式緩沖液終止染色,迅速離心去除上清后將細(xì)胞重新用100μL流式緩沖液懸起,通過細(xì)胞濾網(wǎng)后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。其余經(jīng)紅細(xì)胞裂解處理的細(xì)胞按照細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果直接用流式緩沖液重懸,通過細(xì)胞濾網(wǎng)后放置于冰上,準(zhǔn)備進(jìn)行流式分選。1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周血中單核細(xì)胞的表達(dá)本室購置的流式細(xì)胞儀為BDFACSAriaTMII。根據(jù)外周血各個(gè)成分細(xì)胞的分群,確定單核細(xì)胞在流式細(xì)胞儀中的大小以及顆粒度等特征,限定分選條件,獲取單核細(xì)胞。同時(shí)對(duì)CD14-PE抗體標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行流式分析,確定單核細(xì)胞分群中CD14陽性的細(xì)胞所占比率。1.5細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞分化上述分選得到的單核細(xì)胞經(jīng)300g離心后用含有10%進(jìn)口胎牛血清以及雙抗的RPMI—1640培養(yǎng)基重懸,種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,加入10ng/mLGM-CSF共培養(yǎng)(5~7)d,鏡下觀察分選得到的單核細(xì)胞體外分化的巨噬細(xì)胞形態(tài)。2結(jié)果2.1cd14抗體陽性細(xì)胞分析外周血白細(xì)胞成分血經(jīng)過紅細(xì)胞裂解處理并進(jìn)行CD14抗體預(yù)染,流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果見圖1,左圖為樣品直接流式分群結(jié)果,其中左上角為粒細(xì)胞群,中間圈定細(xì)胞群(P1)為單核細(xì)胞,占白細(xì)胞總數(shù)的8%左右;居中偏下的為淋巴細(xì)胞群。右圖為CD14抗體陽性細(xì)胞(P2),該陽性細(xì)胞群占左圖中單核細(xì)胞分群(P1)的85%~90%左右。結(jié)果證明,根據(jù)目的細(xì)胞群的大小以及顆粒度的差異通過流式細(xì)胞分群方式可以分離并獲取單核細(xì)胞。2.2cd14陽性的細(xì)胞的黨對(duì)cd4的表達(dá)將其余的外周血白細(xì)胞成分血根據(jù)細(xì)胞分群直接選擇單核細(xì)胞群進(jìn)行分選。將分選得到的單核細(xì)胞進(jìn)行CD14抗體標(biāo)記后,再次進(jìn)行流式分析。結(jié)果如圖2,左圖為分選后細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀直接分析,R1即分選得到單核細(xì)胞;右圖顯示該群?jiǎn)魏思?xì)胞分選后CD14抗體標(biāo)記的結(jié)果,CD14陽性的細(xì)胞占分選獲得所有細(xì)胞的比例為85%左右。如在后期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步優(yōu)化條件,預(yù)期可以獲得純度更高的單核細(xì)胞。2.3細(xì)胞形態(tài)觀察上述流式分選得到的單核細(xì)胞經(jīng)過體外分化培養(yǎng)7d,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與文獻(xiàn)報(bào)道一致。證明基于流式細(xì)胞分選得到的人外周血單核細(xì)胞分化正常,可以用于對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)一步的功能研究。3傳統(tǒng)熱點(diǎn)問題進(jìn)行了全面的總結(jié)和論述單核巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究是當(dāng)前免疫學(xué)研究的熱點(diǎn),2011年底,免疫學(xué)國際頂級(jí)期刊《Nature.ReviewsImmunology》對(duì)近年來單核巨噬細(xì)胞的的相關(guān)研究進(jìn)行?？u(píng)述,對(duì)巨噬細(xì)胞的極化過程,巨噬細(xì)胞與感染和免疫、巨噬細(xì)胞與機(jī)體保護(hù)和致病以及巨噬細(xì)胞與重要疾病的關(guān)系等列為免疫學(xué)的前沿領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題進(jìn)行了全面的總結(jié)和述評(píng)。傳統(tǒng)方法對(duì)于單核細(xì)胞的分離過程需要反復(fù)離心清洗,會(huì)造成大量細(xì)胞在操作過程中的遺失,而且操作時(shí)需要對(duì)抗凝血作適當(dāng)稀釋,在血量較多時(shí)要分成數(shù)管進(jìn)行離心,對(duì)于分離試劑的需求較大。如需獲取純度較高的單核細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,則需要進(jìn)一步利用抗體以及磁珠等技術(shù)方法加以純化,增加了實(shí)驗(yàn)成本,而且獲得的單核細(xì)胞容易被激活而給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來影響。基于流式細(xì)胞儀的功能,根據(jù)細(xì)胞的大小以及顆粒度等特征,對(duì)白細(xì)