中華絨螯蟹生精小管生殖細(xì)胞發(fā)育不同步研究

中華絨螯蟹生精小管生殖細(xì)胞發(fā)育不同步研究

近年來，隨著人工育苗技術(shù)的成熟和育種規(guī)模的迅速擴大，對中國的環(huán)腺炎進行了全面研究。對其生殖生物學(xué)研究主要集中在:生殖系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和組織結(jié)構(gòu),雄性生殖系統(tǒng)的組織學(xué),并對雄性生殖細(xì)胞進行了分期,針對性早熟開展的卵巢組織切片觀察等。而對河蟹精巢發(fā)育組織等特征、精巢整體生精小管精子成熟方式和具體的精巢發(fā)育周期的劃分,迄今未見系統(tǒng)報道。該方面的研究將為河蟹的生殖生物學(xué)提供基礎(chǔ)資料,為河蟹的人工繁殖和養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。1材料和方法1.1材料表面河蟹體重10～100g,于2004年3月27日～2004年10月1日,分3次購自白洋淀。1.2巢外部形態(tài)解剖河蟹外部形態(tài)解剖前,稱重河蟹,測量其體長、體寬,并觀察體色,前螯絨毛特征情況。精巢外部形態(tài)解剖后,觀察精巢顏色、位置、形態(tài)等特征,稱重精巢。生殖腺指數(shù)(%)=精巢鮮重(g)/體重(g)×100精巢組織學(xué)活體解剖取精巢,用波恩氏液固定,酒精脫水,石蠟包埋,切片厚度為6～7μm,H.E染色,olympus-II顯微鏡觀察攝影。2結(jié)果2.1生精小管生長規(guī)律精巢1對,玉白色,位于胃的側(cè)后方和心臟兩側(cè)之前方。前端左右分離,而在胃的后方以一橫橋相連接。組織切片觀察,精巢由多數(shù)生精小管盤旋而成,外被一層結(jié)締組織膜。生精小管之間是結(jié)締組織的填充物。生精小管橫切面大多近圓形,不同發(fā)育時期管腔直徑和管壁厚度不同。小管一側(cè)為生精上皮,另一側(cè)為管壁上皮,二者均著生于近基膜處,基膜外側(cè)即與結(jié)締組織相聯(lián)。生精小管中生殖細(xì)胞不斷增殖形成生殖帶。伴隨精巢發(fā)育,生精上皮不斷向管腔內(nèi)分裂增殖,形成不同發(fā)育階段的生殖帶(圖1:1)。管壁上皮細(xì)胞形狀也隨精巢發(fā)育階段不同而發(fā)生變化:從精原細(xì)胞期的長柱狀上皮細(xì)胞(核呈狹長橢圓形)變成精母細(xì)胞期的扁平狀(核變扁平),最后變?yōu)榫悠跁r的膜狀上皮(核短線狀或觀察不到核)。2.2生殖細(xì)胞發(fā)育2.2.1不同發(fā)育階段的生精小胞生發(fā)區(qū)一側(cè)產(chǎn)生精母細(xì)胞,不斷增殖形成生殖帶向管腔推移。生殖帶橫切面通常為橢圓形或不規(guī)則的多邊形。在同一個生精小管的橫切面上,具有不同發(fā)育階段的生殖細(xì)胞(圖1:2)。精原細(xì)胞最大,位于近基膜處,圓形或橢圓形;初級精母細(xì)胞略小于精原細(xì)胞,核圓形或橢圓形;次級精母細(xì)胞直徑與初級精母細(xì)胞相近,核圓形;精細(xì)胞最小,核圓形。2.2.2輸精小管方向組合精巢發(fā)育中,前端頂部的生精小管首先成熟,隨后沿著精巢外緣向末端輸精小管方向推移,成熟的精子進入輸精小管,釋放后,生精小管內(nèi)只留下一些空腔(圖1:3)。這種成熟方式與生殖細(xì)胞在同一生精小管中的發(fā)育相似,都是由一側(cè)向另一側(cè)推進成熟。2.3共筑巢發(fā)育周期依據(jù)河蟹精巢的外部形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及生精小管內(nèi)占優(yōu)勢的生殖細(xì)胞等特點,可以將精巢發(fā)育周期分為以下幾個時期:2.3.1皮細(xì)胞的形態(tài)河蟹體重約10～20g,體長約20～32mm,體寬約20～36mm。精巢乳白色,精巢重量<5mg(鮮重),約1mm,生殖腺指數(shù)<0.02%。生精小管細(xì)小密集,外圍結(jié)締組織較多(圖2:1、2),管壁上皮細(xì)胞較大呈柱狀,排列不規(guī)則,核細(xì)長或橢圓形。管腔內(nèi)精原細(xì)胞占絕大部分,細(xì)胞核近圓形,在各期細(xì)胞中最大,異染色質(zhì)多團塊狀,貼核膜分布或隨機分布(圖2:3、4)。2.3.2精巢發(fā)育迅速,生精小管生長迅速河蟹體重約13～40g,體長約28～40mm,體寬約30～45mm,精巢重5～60mg,生殖腺指數(shù)0.015%～0.15%。精巢發(fā)育迅速,生精小管增多,直徑增大,管壁上皮細(xì)胞變細(xì)長,核變細(xì)長,管腔內(nèi)初級或次級精母細(xì)胞占優(yōu)勢,該期生殖帶最多,同一生精小管內(nèi)出現(xiàn)多種生殖帶(圖2:5)。次級精母細(xì)胞<初級精母細(xì)胞<精原細(xì)胞,染色質(zhì)聚集于核的四周或一側(cè),呈空心圓形或彎月狀(圖2:6),次級精母細(xì)胞核濃縮成圓形或不規(guī)則形,染色后呈均勻的深藍(lán)紫色(圖2:7)。當(dāng)發(fā)育至次級精母細(xì)胞后期時,小管直徑明顯增大,幾乎達(dá)到精細(xì)胞期水平。2.3.3生精小管分布的分布河蟹體重約30～70g,體長約35～65mm,體寬約35～65mm,精巢膨大呈乳白色,重50～300mg,比精母細(xì)胞期明顯增大,生殖腺指數(shù)約為0.15%～0.28%,生精小管直徑約為發(fā)育初期的2～4倍。管壁上皮細(xì)胞形狀近膜狀,上皮細(xì)胞核有的被擠成短線狀;有的已不見細(xì)胞核,只有膜狀上皮。生發(fā)區(qū)精原細(xì)胞生殖帶呈彎月狀位于生精上皮內(nèi)側(cè),生精小管內(nèi)精細(xì)胞占絕大部分。由于染色質(zhì)進一步濃縮,精細(xì)胞核變小,近圓形,直徑約為次級精母細(xì)胞核的1/2～1/3,染色均勻,核呈藍(lán)紫色,細(xì)胞質(zhì)被染成淺粉色(圖2:8)。2.3.4生殖帶和臟器河蟹體重約50～100g,精巢特征與精細(xì)胞后期相近,膨大呈乳白色,生殖腺指數(shù)約為0.2%～0.3%,生精小管直徑無明顯增大,生發(fā)區(qū)精原細(xì)胞生殖帶呈細(xì)彎月狀或消失(圖2:9),管壁上皮細(xì)胞成膜狀,細(xì)胞核呈短線狀,且從精原細(xì)胞期到精子期細(xì)胞有增大的趨勢(圖2:10)。精子圓形,與精細(xì)胞核直徑相近或略小,小管內(nèi)有許多精子鑲嵌在管腔內(nèi)呈暗灰色的營養(yǎng)基質(zhì)網(wǎng)上,已不見精子期時的淺粉色細(xì)胞質(zhì)(圖2:10～12),部分精子成熟后從生精小管內(nèi)釋放形成空腔,一般在生發(fā)區(qū)對應(yīng)的另一側(cè)管壁上皮內(nèi)側(cè)先成熟釋放,精子排出的部位形成空腔,小管壁變厚,管壁細(xì)胞恢復(fù)柱形或不規(guī)則多邊形。2.3.5精子濃度的影響該期河蟹規(guī)格與處于精子期河蟹無明顯變化,精巢乳黃色,柔軟,由于精子排出,生殖腺指數(shù)變小,精巢內(nèi)結(jié)締組織增多,管壁上皮細(xì)胞變厚,生精小管內(nèi)精子基本排空,管壁內(nèi)陷,凹凸不平(圖2:13)。2.4精巢發(fā)育的發(fā)育時期河蟹性早熟現(xiàn)象比較普遍,其個體雖小,但精巢發(fā)達(dá),生精小管直徑粗大,已達(dá)到正常發(fā)育的成熟河蟹的精巢水平,生殖腺指數(shù)明顯大于正常成熟河蟹,生殖細(xì)胞也已基本發(fā)育成熟,達(dá)精細(xì)胞期甚至精子期,具有不同于正常發(fā)育個體的獨特外部表現(xiàn)。河蟹精巢通常伴隨個體生長逐漸發(fā)育,但不同大小的個體之間,精巢發(fā)育狀況差異極大。少數(shù)試驗河蟹體重、精巢重均與處于精母細(xì)胞期的正常發(fā)育個體相似,小管直徑略粗于正常發(fā)育精母細(xì)胞期小管直徑,但其生精小管內(nèi)的生殖細(xì)胞絕大多數(shù)已達(dá)精細(xì)胞或精子期(圖3:1、2);個別河蟹雖然精巢內(nèi)占優(yōu)勢的生殖細(xì)胞帶為精母細(xì)胞,但其生殖腺發(fā)育指數(shù)相對正常發(fā)育個體較大,生殖細(xì)胞正處于發(fā)育過程中,精母細(xì)胞最多,已生成較多精細(xì)胞。2.5性早熟河蟹生長的形態(tài)一只左前螯無絨毛,右前螯有絨毛的特殊河蟹,絨毛沒有觀察到被人工機械除掉的可能,表現(xiàn)為自身沒有生長的跡象。體重24.4g,體長36mm,體寬39mm,體表顏色發(fā)白色,并不具備性早熟河蟹的外部特征(圖4,圖5)。但精巢重182mg,比同等大小的正常發(fā)育河蟹發(fā)達(dá)得多,生殖腺指數(shù)達(dá)到0.74%,生精小管粗大,內(nèi)部充滿精子,精巢發(fā)育達(dá)到精子期水平(圖6:1,2)。3討論3.1不同生精小管中生殖細(xì)胞的發(fā)育精巢由生精小管組成,生殖細(xì)胞在同一個和不同生精小管中發(fā)育相似。例如,生殖細(xì)胞在同一生精小管由生發(fā)區(qū)開始,不斷向內(nèi)成熟推進,成熟的精子進入輸精小管管腔。這與中國對蝦(Penaeusorinentalis)、紅螯螯蝦(Cheraxquadricairnatus)相似。筆者觀察到:同一個生精小管內(nèi)和不同生精小管內(nèi)生殖細(xì)胞的發(fā)育都不同步,但同一個生殖帶內(nèi)生殖細(xì)胞的發(fā)育處于同一時期;這一點與已報道的紅螯螯蝦精巢生殖細(xì)胞的發(fā)育特點不同,紅螯螯蝦精巢內(nèi)不同生精小管的生殖細(xì)胞的發(fā)育是不同步的,但同一生精小管內(nèi)生殖細(xì)胞的發(fā)育基本相同。精巢整體生精小管生殖細(xì)胞的成熟方式:由精巢前端頂部開始,沿精巢外緣向末端輸精小管方向推移,最終成熟的精子進入輸精小管。無論在生精小管的橫向切片上,還是縱向的發(fā)育切片上,生殖細(xì)胞的發(fā)育都是由遠(yuǎn)離輸精小管的一端首先產(chǎn)生,隨后逐漸發(fā)育成熟,向輸精小管方向推進,成熟的精子進入輸精小管管腔。這樣的組織學(xué)結(jié)構(gòu),使整條生精小管在長度不同的各個部位能同時產(chǎn)生成熟精子,由于生精小管內(nèi)生殖細(xì)胞發(fā)育不同步,使精巢能連續(xù)不斷地產(chǎn)生精子;同時由于精巢整體生精小管生殖細(xì)胞的發(fā)育由精巢前端頂部開始,逐漸向末端輸精小管方向推進成熟,也有利于成熟精子連續(xù)的產(chǎn)生。這在生理功能上保證精子持續(xù)供給,進而保證河蟹在繁殖季節(jié)的多次交配和繁殖。3.2精子細(xì)胞期和休止期依據(jù)河蟹精巢的外部形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及生精小管內(nèi)占優(yōu)勢的雄性生殖細(xì)胞種類和數(shù)量,河蟹精巢發(fā)育可分為5個時期,即精原細(xì)胞期,精母細(xì)胞期,精子細(xì)胞期,精子期和休止期。研究結(jié)果與堵南山的結(jié)果一致。由于個體之間發(fā)育的差異性,體重、體長、體寬指標(biāo)并不能充分反應(yīng)其發(fā)育情況,由表1可以看出,它們的發(fā)育階段與3個指標(biāo)都有交叉,而且用精巢組織切片分期來替代按性腺發(fā)育分期更準(zhǔn)確。單一的指標(biāo)例如體重等,并不能完全的反應(yīng)精巢發(fā)育的變化。本研究把體重、體長、體寬、精巢重等因素與精巢發(fā)育相結(jié)合,可以全面理解河蟹精巢發(fā)育階段,為生殖生物學(xué)提供基礎(chǔ)資料。3.3精巢內(nèi)精細(xì)胞的發(fā)育中華絨螯蟹雌蟹的成熟時間因地理緯度的不同而有所差異。吳萍等研究表明:3月下旬,精巢初步發(fā)育,6月份,精巢內(nèi)已開始有初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞形成,7月份,精巢內(nèi)已經(jīng)有精細(xì)胞,一般自10月份至翌年3月,精巢內(nèi)精細(xì)胞處于分化后期。葉海輝發(fā)現(xiàn),廈門海區(qū)的鋸緣青蟹精巢季節(jié)周期變化不很明顯,而在白洋淀購置的河蟹,由于養(yǎng)殖的原因,精巢發(fā)育季節(jié)周期變化不明顯。3.4精巢重、精巢重生殖腺指數(shù)在5個時期都有交叉,這和個體之間差異性有關(guān)。精原細(xì)胞期到精子期河蟹體重增加,精巢重也增加,但相對而言,精巢發(fā)育迅速,生殖腺指數(shù)隨發(fā)育逐漸增大;到了休止期,河蟹體重基本沒有增加,而由于精巢中精子的排出,精巢內(nèi)部形成很多空腔,盡管生精小管管壁變厚,內(nèi)部結(jié)締組織增多,但是精巢重還是呈下降趨勢,生殖腺指數(shù)減小。3.5性早熟的結(jié)構(gòu)表征目前,河蟹養(yǎng)殖中1齡蟹性早熟是養(yǎng)殖業(yè)較為普遍的問題。關(guān)于性早熟原因的分析與探討,已經(jīng)有很多報道,但大多集中在外因和外因引起性腺成熟。另外也有過一些內(nèi)分泌方面的研究,康現(xiàn)江等研究過X器官-