liddle綜合征患者的臨床特征及基因診斷

liddle綜合征患者的臨床特征及基因診斷

liddle綜合征的發(fā)病機(jī)制李家綜合征是一種常見(jiàn)的高血壓病，具有先發(fā)高血壓、低鉀、低腎素和低醇血癥。它對(duì)酶誘導(dǎo)劑（enac）鈉通道（na）的抑制非常敏感，但對(duì)環(huán)磷酰胺吡啶沒(méi)有敏感。近年來(lái)，由于活佛和分子遺傳的發(fā)展，對(duì)lidle綜合征的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入研究。該綜合征的遺傳基礎(chǔ)為編碼ENaC的基因的β或γ亞單位發(fā)生突變引起上皮鈉通道過(guò)度激活導(dǎo)致腎臟遠(yuǎn)曲小管對(duì)鈉水重吸收增強(qiáng)所致。由于臨床醫(yī)生對(duì)繼發(fā)性高血壓診治重視不夠,使得Liddle綜合征一直被視為一種罕見(jiàn)病,患者長(zhǎng)時(shí)間被誤診,造成血壓控制困難,大量應(yīng)用降壓藥物導(dǎo)致藥物副作用增加,早年發(fā)生心腎功能不全等靶器官損害,腦卒中甚至猝死。Liddle綜合征分子遺傳機(jī)制的研究使基因診斷成為快速準(zhǔn)確診斷的有效方法,本文對(duì)兩例臨床疑似Liddle綜合征的患者進(jìn)行外周血SCNN1B和SCNN1G基因檢測(cè),明確診斷、指導(dǎo)治療,打破基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)之間的屏障,把基礎(chǔ)研究獲得的知識(shí)成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。1對(duì)象和方法1.1研究對(duì)象和方法1.1.1中心住院的臨床特征2例于2010年6月至2010年10月在阜外心血管病醫(yī)院高血壓診治中心住院的臨床初診Liddle綜合征先證者和此兩個(gè)家系的38位家系成員,先證者臨床特征為發(fā)病年齡小,高血壓家族史,口服多種降壓藥血壓難以控制,低血鉀,低腎素,低醛固酮,腎上腺CT檢查未發(fā)現(xiàn)明顯異常等。1.1.2首先，采集和處理樣本并進(jìn)行評(píng)估1.2鏈反應(yīng)試驗(yàn)1.2.1外周血DNA的提取(鹽析法);1.2.2采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)擴(kuò)增目的片段;1.2.3基因測(cè)序:將相應(yīng)外顯子的擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京華大基因科技公司測(cè)序,以PCR正向引物為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序;2結(jié)果2.1.家庭與繁殖2.2家庭與系統(tǒng)22.3治療配合性血鉀兩個(gè)家系中共8例Liddle綜合征患者明確診斷,給予適當(dāng)限鈉及口服阿米洛利5mgqd,監(jiān)測(cè)血壓和血鉀水平,療效顯著,1個(gè)月后8位患者血鉀及血壓水平見(jiàn)表1。3py基序基因突變本研究對(duì)2例青年難治性高血壓患者進(jìn)行了臨床生化和ENaCβ亞單位和γ亞單位的基因突變檢測(cè),在編碼ENaCβ亞單位的SCNNB1基因的13號(hào)外顯子發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)錯(cuò)義突變(P614L和P616S),其中P614L為世界首次報(bào)道的新突變,明確了Liddle綜合征的診斷,兩例患者均有早發(fā)高血壓家族史,收集兩個(gè)家系的成員,6例家系成員(不包括先證者)被確診為該綜合征,確診患者均接受限鹽和口服阿米洛利治療,療效顯著。Liddle綜合征的臨床特征最初由GrantLiddle等人在1963年詳細(xì)描述,其分子基礎(chǔ)是ENaC基因(SCNN1B和SC-NN1G)功能獲得性突變,最常見(jiàn)的突變是β或γ亞單位C羧基末端和富含脯氨酸的高度保守序列PY基序(P:脯氨酸、Y:酪氨酸、L:亮氨酸)斷裂、錯(cuò)義、缺失、提前產(chǎn)生終止密碼或移碼突變所致。本研究的兩個(gè)Liddle綜合征家系的錯(cuò)義基因突變均位于ENaCβ亞單位的PY基序。Liddle綜合征關(guān)鍵性的病理生理改變是遠(yuǎn)端腎小管的ENaC對(duì)鈉的重吸收增加,細(xì)胞外液容量擴(kuò)張。PY基序基因突變導(dǎo)致Nedd4-2的WW結(jié)構(gòu)域不能與ENaCβ,γ亞單位的PY基序結(jié)合,使大量活性ENaC內(nèi)吞和降解不能發(fā)生,導(dǎo)致ENaC在遠(yuǎn)端腎小管密度增加,且持續(xù)性活化,鈉重吸收增加,血壓升高,醛固酮和腎素分泌受抑,鉀重吸收減少,出現(xiàn)Liddle綜合征的一系列臨床癥狀。有關(guān)ENaC通道功能的定量研究顯示,導(dǎo)致Liddle綜合征的基因突變從增加ENaC通道的表達(dá)數(shù)量及該通道開(kāi)放的幾率兩方面影響ENaC功能,研究者將攜帶引起Liddle綜合征的PY基序的缺失或錯(cuò)義突變的ENaC在爪蟾卵細(xì)胞上表達(dá),發(fā)現(xiàn)ENaC電流較野生型ENaC電流明顯增加,驗(yàn)證了以上突變是導(dǎo)致Liddle綜合征的原因。另有研究證實(shí),患者淋巴細(xì)胞膜鈉通道活性較正常對(duì)照者淋巴細(xì)胞膜鈉通道活性明顯增加。另外,Knight等發(fā)現(xiàn),基因突變不僅增加細(xì)胞膜ENaC的表達(dá),而且可以通過(guò)增加通道開(kāi)放的程度使ENaC得活性處于最高狀態(tài);在鼠腎臟的集合管細(xì)胞中,EGF通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路抑制阿米洛利敏感的鈉通道電流并且降低ENaCmRNA的表達(dá),最近有研究顯示,PY基序的基因突變可阻斷表皮生長(zhǎng)因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal–regulatedkinases,ERK)信號(hào)通路抑制ENaC的表達(dá),使遠(yuǎn)端腎小管ENaC的數(shù)量和活性大增,集合管主細(xì)胞對(duì)鈉的重吸收,導(dǎo)致Liddle綜合征;以上研究揭示了Liddle綜合征分子遺傳機(jī)制為最終的基因治療積累資料,并有助于拓寬對(duì)原發(fā)性高血壓的認(rèn)識(shí),闡明發(fā)病機(jī)理,開(kāi)辟防治新思路。許多臨床醫(yī)師常常認(rèn)為L(zhǎng)iddle綜合征發(fā)病率低,且對(duì)其危害認(rèn)識(shí)不足,未給予足夠重視,然而,最近美國(guó)一項(xiàng)對(duì)149例血鉀低于4.0mmol/L且患有高血壓的退伍軍人進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果顯示Liddle綜合征發(fā)病率高達(dá)6%,Liddle綜合征患者具有發(fā)病年齡小,容易出現(xiàn)靶器官損害,故對(duì)于年齡<30歲的高血壓患者,一旦有高血壓家族遺傳史,且具有低血漿腎素活性,低血鉀等特征時(shí),應(yīng)考慮進(jìn)行SCNN1B和SCNN1G基因篩查,有助于早期病因診斷,早期指導(dǎo)治療,Liddle綜合征患者一旦確診,給予限鹽和口服阿米洛利或氨苯喋啶可收到良好的治療效果,從而避免惡性心血管事件的發(fā)生。在征得先證者及家系成員知情同意后,采集5%EDTA抗凝靜脈血,-80℃保存,用鹽析法或試劑盒抽提外周血基因組DNA,-20℃保存待用。正常對(duì)照血樣采自150位健康人,均無(wú)尿檢和腎功能異常,無(wú)腎病家族史。家庭成員需簽署知情同意書(shū)。1.2.4通過(guò)NCBI的BLAST2sequences和UCSC的BLATsearch,將測(cè)序結(jié)果與Genebank中的基因原始序列進(jìn)行比對(duì),同時(shí)對(duì)測(cè)序所得的基因序列圖譜進(jìn)行分析,以確定是否存在基因突變。如果存在基因突變,首先對(duì)該突變進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析,以確定該突變是否為已知正常多態(tài)位點(diǎn),其次查詢國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),以排除是否為已報(bào)道突變;最后,如果確定為新的突變,尚需對(duì)150例無(wú)血緣關(guān)系的健康人群進(jìn)行該位點(diǎn)的基因擴(kuò)增,測(cè)序,以排除所發(fā)現(xiàn)的突變?yōu)槲粗巳憾鄳B(tài)位點(diǎn)的可能。1.3ccc、tcc突變對(duì)通過(guò)基因診斷確診的患者給予適當(dāng)限鈉及口服阿米洛利5mgqd,并對(duì)其進(jìn)行隨訪,監(jiān)測(cè)血壓和血鉀水平。序列分析:先證者Ⅲ’-7,和家系成員Ⅱ’-7和Ⅰ’-7的βENaC13號(hào)外顯子第616號(hào)密碼子均發(fā)生CCC>TCC雜合錯(cuò)義突變,使編碼的氨基酸脯氨酸(Pro)被絲氨酸(Ser)替換,見(jiàn)圖4,正反向測(cè)序結(jié)果相同。γENaC13號(hào)外顯子的擴(kuò)增片段為390bp(密碼子524~631),所有家系成員均未檢測(cè)到任何突變。正常對(duì)照者均未發(fā)現(xiàn)攜帶P616S突變。2.2.3外周血靜脈血中血的檢測(cè)該家系中共有22人,先證者的大舅于46歲時(shí)猝死,生前有高血壓病史,先證者的外公75歲時(shí)死于肝癌,無(wú)高血壓病史。其他人員均列入研究。所有個(gè)體均在清晨臥位空腹抽取外周靜脈血,作DNA抽提及生化檢測(cè),生化檢測(cè)指標(biāo)包括血漿腎素活性、血漿醛固酮和血鉀,其結(jié)果見(jiàn)表1。成員:該家系來(lái)自湖北省武漢市。先證者有明確的高血壓家族史,其母親在25歲時(shí)患有高血壓,血壓最高達(dá)190//110mmHg,自行口服硝苯地平緩釋片30mgbid,血壓控制不理想,波動(dòng)在160-180/100-110mmHg之間,血鉀未檢測(cè)。先證者父親身體健康,無(wú)高血壓病史,故此家系為母系遺傳,家系圖見(jiàn)圖3。2.2.2入院后生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果先證者2:女,17歲,患者于半年前體檢發(fā)現(xiàn)血壓升高,于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院測(cè)得血鉀2.3mmol/L,血壓210/120mmHg,給予口服氯化鉀緩釋片2gTid,安博諾150mgqd,倍他樂(lè)克25mgqd,硝苯地平控釋片30mgbid,口服藥物后,但血壓水平仍波動(dòng)于180-200/100-110mmHg之間,患者為明確高血壓原因來(lái)阜外心血管病醫(yī)院高血壓診治中心就診,入院后生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:血鈉:144mmol/L(正常參考值:135-145mmol/L),血鉀:2.68mmol/L(正常參考值:3.5-5.5mmol/L),氯105.3mmol/L(正常參考值:96-108mmol/L),二氧化碳:27.7mmol/L(正常參考值:21-31mmol/L),腎上腺CT結(jié)果未見(jiàn)明顯異常。2.2.1臨床數(shù)據(jù)2.2.4輔助檢查結(jié)果分析:家系2中3例基因突變(SCNN1BP616S)高血壓患者Ⅲ’-7,Ⅱ’-7和Ⅰ’-7均表現(xiàn)為高血壓、低血鉀、低血漿腎素活性及低醛固酮血癥,因此,可明確Liddle綜合征的診斷。其余家系成員無(wú)高血壓、低血鉀等臨床癥狀,且上皮鈉通道β和γ亞單位均未發(fā)現(xiàn)基因突變,可排除Liddle綜合征的診斷。2.1.1臨床資料先證者1:男,19歲,患者于一年前體檢發(fā)現(xiàn)血壓升高,于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院測(cè)得血鉀2.0mmol/L,血壓220/130mmHg,給予口服氯化鉀緩釋片2gTid,倍他樂(lè)克25mgbid,硝苯地平控釋片30mgbid,馬來(lái)酸依那普利20mgqd,口服藥物后,血壓水平仍波動(dòng)于190-200/100-110mmHg之間,阜外心血管病醫(yī)院行輔助檢查結(jié)果:生化指標(biāo):血鈉:142.7mmol/L(正常參考值:135-145mmol/L),血鉀:2.31mmol/L(正常參考值:3.5-5.5mmol/L),氯101.7mmol/L(正常參考值:96-108mmol/L),二氧化碳:28.8mmol/L(正常參考值:21-31mmol/L),腎上腺CT結(jié)果未見(jiàn)明顯異常。該家系中共有25人,先證者的父親、三伯和五叔均死于腦卒中,除成員Ⅲ3和Ⅲ4未做檢查外,其他人員均列入研究。所有個(gè)體均在清晨臥位空腹抽取外周靜脈血,作DNA抽提及生化檢測(cè),生化檢測(cè)指標(biāo)包括血漿腎素活性、血漿醛固酮和血鉀,其結(jié)果見(jiàn)表1。2.1.3DNA序列分析:先證者Ⅲ-7,和家系成員Ⅱ-3,Ⅲ-6,Ⅲ-8和Ⅲ-9的βENaC13號(hào)外顯子第614號(hào)密碼子均發(fā)生CCG>CTG雜合錯(cuò)義突變,使編碼的氨基酸脯氨酸(Pro)被亮氨酸(Leu)替換,見(jiàn)圖2,正反向測(cè)序結(jié)果相同。γENaC13號(hào)外顯子的擴(kuò)增片段為390bp(密碼子524～631),所有家系成員均未檢測(cè)到任何突變。正常對(duì)照者均未發(fā)現(xiàn)攜帶P614L突變。2.1.4家系1分析:家系中5例基因突變(SCN