泌香期林不足林的性激素變化規(guī)律

泌香期林不足林的性激素變化規(guī)律

雄性林麝香具有較高的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值。它被廣泛應(yīng)用于亞洲的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和國際香料行業(yè)。由于市場的巨大需求，人類“殺害麝香并吸取香味”，導(dǎo)致森林砍伐棲息地的嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致該動物滅絕。2003年，該書被提升為國家二級保護(hù)動物。為了科學(xué)而有效地保護(hù)利用這種珍貴的野生動物資源,需要對其影響泌香量的性激素進(jìn)行分析研究。性激素的大量研究表明其和動物的繁殖有著密切關(guān)系,例如有研究表明小熊貓血清雌二醇、孕酮含量變化直接反映其繁殖規(guī)律;在未受孕的月經(jīng)周期內(nèi),雌性川金絲猴的邀配行為受雌二醇水平的調(diào)控;Asa等報道,雖圈養(yǎng)狼血清雌二醇水平在發(fā)情前和發(fā)情期增加,但與尿標(biāo)記行為顯著不相關(guān);麋鹿的糞樣性激素水平表現(xiàn)出明顯的季節(jié)變化,雄鹿繁殖行為的發(fā)生頻次與糞樣睪酮水平呈顯著地正相關(guān);非動情象尿液中孕酮和雌二醇水平顯著低于受孕象相應(yīng)的激素水平。麝香腺是雄麝的副性征,受雄性激素調(diào)節(jié)和控制,Wisoloski研究表明,將外源雄激素注入正?；蜷幐畹男坌詣游矬w內(nèi)會提高副性腺的重量和功能。汪建隆等研究表明性激素(促卵泡素FSH與促黃體生成素LH)可以影響麝香分泌。洪沂生等對切除睪丸和附睪的雄麝、失去自然泌香能力的雄麝和非泌香期的雄麝進(jìn)行外源雄性激素的誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)雄麝都會重新分泌麝香。尹淑媛等進(jìn)一步證明了外源雄性激素可誘導(dǎo)雄麝的泌香活動。以上研究結(jié)果表明,性激素LH、FSH、LRH可以影響麝香分泌,丙酸睪丸素、LRH、HCG、LH可以促進(jìn)麝香的分泌。應(yīng)用放射免疫分析法(RIA)測定血液類固醇激素以檢測動物繁殖機(jī)能的技術(shù)已得到了廣泛的應(yīng)用,但就珍稀野生動物、應(yīng)激強(qiáng)烈的動物及難以保定的大家畜而言,該方法的應(yīng)用受到限制。持續(xù)捕捉和靜脈穿刺對動物來說就是一種應(yīng)激反應(yīng),會影響它們的生理狀態(tài)進(jìn)而影響其繁殖機(jī)能。近年來,人們建立了一種以糞樣和尿樣代替血樣,以非侵害性的內(nèi)固醇激素測定來監(jiān)測動物的生理繁殖機(jī)能的新方法,得到了廣泛利用,這一技術(shù)長期用于大、中型珍稀哺乳動物(如非洲象、大熊貓、鹿、馬來西亞貘、大猩猩、狒狒、大羚羊、牦牛、斑馬等)的研究,在林麝性激素方面的研究主要用來與評估動物青春期的健康狀況、判斷動物的排卵方式、早孕診斷、產(chǎn)期預(yù)測等,有關(guān)雄麝糞樣性激素變化與泌香量關(guān)系的研究,至今尚未見報道。本研究擬采用放射免疫分析法(RIA)對林麝泌香期糞樣中性激素水平進(jìn)行測定,以期分析出雄性林麝泌香期性激素分泌的變化規(guī)律,探究雄性林麝泌香期性激素水平與泌香量的關(guān)系,為提高麝香產(chǎn)量提供科學(xué)依據(jù),具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和學(xué)術(shù)價值。1材料和方法1.1雄膠囊的年齡分布本研究于2010.04-2011.12在陜西鎮(zhèn)坪縣養(yǎng)麝場進(jìn)行。該麝場創(chuàng)建于1958年,是全國三大野麝家養(yǎng)試驗場之一。全場占地總面積80942m2,現(xiàn)存欄社群150只(其中,成年麝88只,仔麝62只)。根據(jù)雄麝年齡與泌香的關(guān)系,把林麝分為以下4個年齡段:初次泌香階段,1歲(9頭);泌香盛期階段,2~7歲(30頭);泌香下降階段,8~10歲(10頭);泌香少甚至不再泌香階段,10歲以上(1頭)。由于年齡大的林麝泌香少或已不再泌香,屬于淘汰對象,導(dǎo)致該年齡段樣本少。本試驗以上述4個年齡階段健康雄麝共50頭為研究對象,每頭均扎有塑料耳號,有各自獨(dú)立的圈舍空間。1.2雄鱗癌保幼期香腺發(fā)育情況糞樣的收集是在6個不同時期進(jìn)行:第一個時期為林麝無任何泌香生理反應(yīng)的正常時期(normal,N,2010.04.05-04.10采樣);第2個時期是泌香期前(beforemusk-secretingPeriod,BMSP,2010.04.28-05.05采樣),此期是雄麝泌香生理上的準(zhǔn)備期,香腺分泌細(xì)胞已有特殊的分泌物。第3個時期是泌香初期(Primemusk-secretingPeriod,PMSP),雄麝食量開始遞減,睪丸、陰囊腫脹下垂,香腺體積明顯增大,開始分泌少量初香液。第四個時期是泌香盛期(vigorousmusk-secretingPeriod,VMSP),雄麝睪丸、陰囊持續(xù)增大腫脹,分泌大量初香液,排入香囊腔,并伴有“拒食”反應(yīng),飲水量也大減,少活動,多安靜站立。第五個時期是泌香后期(latermusk-secretingPeriod,LMSP),雄麝睪丸、陰囊及香腺開始縮小,腫脹消退,進(jìn)食與其他行為逐漸恢復(fù)。第六個時期是泌香期后(aftermusk-secretingPeriod,AMSP),是初香液在香囊腔內(nèi)的熟化過程。后面的這幾個時期根據(jù)每個林麝的具體生理、行為特點(diǎn)而進(jìn)行采樣。一般在反應(yīng)次日清晨采集新鮮糞便,將其放入一次性滅菌自封袋中,記錄糞便采集日期、時間、個體編號等,使用冰盒運(yùn)回實(shí)驗室,-20℃冷凍保存。1.3雄傳統(tǒng)的案外觀雄麝的自然泌香每年1次,出現(xiàn)在5~7月間。麝香是雄麝的肚臍和生殖器之間的腺囊的分泌物。追蹤5歲的雄麝10頭連續(xù)2年的泌香量,記錄數(shù)據(jù)。1.4糞樣中二氯甲烷的制備以李春旺等的方法,改進(jìn)后用來提取糞樣中的激素,具體步驟如下:睪酮和孕酮的提取:將濕糞樣混合均勻,去除石礫和雜物,取2份各稱取1.0g左右,1份120℃烘干后再稱重,測含水量。另1份冷凍干燥后在冰上研磨混勻,取0.5g加入甲醇/蒸餾水(8∶1)的混合液4mL,振蕩10min;再加入2mL石油醚振蕩1min(以除去脂質(zhì)),然后-4℃、4000r/min離心10min,取甲醇層2mL于小試管中,作為待測樣品。按同樣方法取2份糞便。另1份冷凍干燥后在冰上研磨混勻,取0.5g濕糞樣,加3mL二氯甲烷和1.3mL氫氧化鉀(0.1mol/L),振蕩5mim,然后-4℃、2000r/min離心10min,吸去水層,取其二氯甲烷層3mL于另一試管中,用1mL蒸餾水洗該二氯甲烷2次,后取1mL二氯甲烷層于小試管中,使用真空冷凍干燥機(jī)(0℃,12h)對樣品進(jìn)行冷凍干燥。測定雌二醇前,向蒸干待測的小試管中加入0.6mL0.1%的磷酸鹽明膠緩沖液(GPS),振蕩3min,構(gòu)成待測樣品。1.5雙管平行測定用北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的睪酮、雌二醇、孕酮放射免疫分析測定試劑盒對采自雄麝糞樣中的睪酮(T)、雌二醇(E2)、孕酮(P)進(jìn)行雙管平行測定。將各個濕糞樣的激素含量換算成干糞樣中的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方式為四參數(shù)方程法,R2均接近1。測定的儀器是中國核工業(yè)部西安二六二廠生產(chǎn)的全自動十探頭γ免疫計數(shù)器(XH-6080)。1.6數(shù)據(jù)分析使用MicrosoftExcel2003軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及作圖,采用SAS9.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析及相關(guān)性分析。2結(jié)果與分析2.1雄液壓時代的血清睪丸酮含量雄麝不同年齡階段不同時期睪酮的變化規(guī)律如圖1和表1所示。雄麝各個不同時期均表現(xiàn)出規(guī)律性的變化曲線:在無任何泌香生理反應(yīng)的正常時期,糞樣中睪酮含量最低;泌香期前睪酮的含量開始升高;泌香初期,睪酮含量急劇升高,顯著高于正常期(P<0.05),2~7歲顯著高于泌香期前(P<0.05);泌香盛期,睪酮的含量繼續(xù)升高,達(dá)到最高峰,顯著高于其它各個時期(P<0.05);泌香后期睪酮的含量開始下降;泌香期后睪酮的含量繼續(xù)下降。雄麝4個年齡階段表現(xiàn)出相似的睪酮的含量變化規(guī)律,以2~7歲年齡段睪酮含量最高(3766.82±98.48)ng/g,1歲年齡段睪酮含量最低(2409.68±99.94)ng/g)。在2~7歲年齡段,泌香期初期雄麝睪酮的含量與泌香期前差異顯著(P<0.05),其它年齡段差異均不顯著。2.2泌香期前后雄噴植物群落各年齡的基本成分比較雄麝同一時期不同年齡階段睪酮含量變化見表2。從表2可以看出,正常期各年齡階段差異不顯著,泌香期前、泌香初期、泌香盛期2~7歲與1歲雄麝睪酮含量差異顯著(P<0.05),泌香盛期8~10歲與1歲雄麝睪酮含量差異不顯著,泌香期后期1歲與2~7、8~10歲雄麝睪酮含量差異顯著(P<0.05),泌香期后各年齡階段差異均顯著(P<0.05)。2.3雄鱗癌組織中二醇含量的變化雄麝雌二醇含量的變化規(guī)律如圖2和表3所示。雄麝各個不同年齡階段均變現(xiàn)出規(guī)律性變化曲線,在無任何泌香生理反應(yīng)的正常時期,其糞樣中雌二醇含量較低;泌香期前雌二醇的含量開始升高;泌香初期,雌二醇含量急劇升高,顯著高于正常期(P<0.05),尤其1歲、2~7歲雄麝還顯著高于泌香期前;泌香盛期,雌二醇的含量繼續(xù)升高,達(dá)到最高峰,除了8~10歲雄麝的雌二醇含量與泌香期后期差異不顯著外,顯著高于其它各個時期(P<0.05);泌香后期雌二醇的含量開始下降,尤其2~7歲雄麝雌二醇的含量與泌香期初期差異顯著(P<0.05);泌香期后除了1歲雄麝雌二醇的含量出現(xiàn)上升外,其它年齡階段繼續(xù)下降,各個年齡階段雄麝雌二醇的含量與泌香期前差異不顯著。2.4不同年齡、泌香期、年齡雄鱗行政期后二醇含量的變化雄麝同一時期不同年齡階段雌二醇含量變化見表4。從表4可以看出,正常期、泌香期初期1歲與2~7歲、8~10歲雄麝雌二醇的含量差異顯著(P<0.05),泌香期后期1歲與8-10歲雄麝雌二醇的含量差異顯著(P<0.05),其它各時期差異均不顯著。2.5雄鱗癌的泌香情況1歲雄麝糞樣中睪酮、雌二醇含量的規(guī)律性變化如圖3所示,其他2個年齡階段糞樣中睪酮、雌二醇含量變化曲線圖與1歲雄麝的相似:在正常期睪酮、雌二醇的含量較低,隨后不斷上升,在泌香盛期均達(dá)到最高峰,除1歲雄麝在泌香期后出現(xiàn)上升外,其他2個年齡段之后不斷下降。由圖可見,雄麝睪酮含量變化迅速,而雌二醇含量水平變化平穩(wěn)。經(jīng)相關(guān)分析得出:雄麝的泌香量與睪酮的含量之間呈顯著強(qiáng)正相關(guān):Y=0.0011X+8.6072(R2=0.6504,P<0.05)。林麝的泌香量與雌二醇的含量之間呈顯著正相關(guān):Y=0.0043X+10.231(R2=0.4565,P<0.05)。2.6生殖動物自身含量的變化與睪酮及雌二醇表現(xiàn)出明顯規(guī)律性變化相反,泌香期雄性林麝孕酮的含量未呈現(xiàn)出規(guī)律性變化,主要原因可能是孕酮的變化主要在雌性動物妊娠期。孕酮對雄性動物生殖活動的作用,主要通過生物合成雄激素和雌激素來體現(xiàn),而且孕酮具有一定的周期性、陣發(fā)性、季節(jié)性。3泌香期各階段劃分在動物激素水平研究中,一般采用動物肌肉和血液樣品進(jìn)行分析,這樣會影響動物正常的內(nèi)分泌水平,干擾動物的正常生理狀態(tài),導(dǎo)致測定結(jié)果出現(xiàn)偏差,且對于一些敏感物種而言,強(qiáng)迫性的采樣還會造成動物生理和心理的損傷。野生動物數(shù)量少,取樣難度大,這些都給野生動物研究帶來很大不便。應(yīng)用糞樣中類固醇激素研究野生動物繁殖生物學(xué)主要對于人工圈養(yǎng)或半敞放養(yǎng)的野生動物比較實(shí)用。由于動物糞樣容易收集,易于保存,對動物的影響較小,因此非損傷性采樣在野生動物研究中得到了廣泛的應(yīng)用。糞樣分析已經(jīng)用于動物的領(lǐng)域、食性、消化動態(tài)、疾病與寄生蟲、種群數(shù)量和遺傳結(jié)構(gòu)、有效種群大小、食物鏈與食物網(wǎng)、能量流與物質(zhì)流的研究等方面。在動物的研究和保護(hù)中,通過糞樣可以得到許多關(guān)鍵性問題的答案。因此,利用林麝的糞樣研究類固醇激素的變化規(guī)律是切實(shí)可行的,但在采樣過程中應(yīng)注意以下環(huán)節(jié),不同個體之間在進(jìn)入泌香期時間前后不一,進(jìn)入泌香期的各階段時間長短不等,這就需要認(rèn)真觀察其生理、行為反應(yīng)。林麝睪丸、陰囊的形態(tài)變化是反映泌香期的良好指標(biāo)。林麝睪丸開始腫大是泌香期來臨的征兆。隨著林麝睪丸、陰囊腫大的過程,香囊內(nèi)香液逐漸增加,又隨著睪丸、陰囊腫大的消退,香囊內(nèi)香液逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轺晗?。林麝泌香期結(jié)束,睪丸、陰囊也恢復(fù)原狀。而林麝采食行為的急劇變化—減食、停食則是其進(jìn)入泌香盛期的顯著標(biāo)志。林麝進(jìn)入泌香期的各階段劃分,除了依據(jù)生理反應(yīng),還應(yīng)根據(jù)糞樣的顏色、氣味、濕干程度進(jìn)行確定。故本方法適用于珍稀野生動物、應(yīng)激強(qiáng)烈的動物及難以保定的大家畜的類固醇激素研究,具有廣泛的應(yīng)用價值。睪酮的生理作用主要為促進(jìn)雄性生殖器官的發(fā)育和第二性征的出現(xiàn),促進(jìn)精子的發(fā)生與成熟,刺激并提高雄性性欲等。睪酮還與雄性的交配行為和社會行為密切相關(guān)。雌激素對雄性動物的生殖活動主要表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。大劑量雌激素可引起雄性胚胎雌性化,并對雄性第二性征和性行為發(fā)育有抑制作用。泌香機(jī)能是雄麝特有的生理機(jī)能,麝香囊及香腺是雄麝獨(dú)具的副性征。動物體中,副性征的活動受雄性激素的調(diào)節(jié)是普遍規(guī)律?？梢?性激素與麝泌香的關(guān)系十分密切,在雄麝體內(nèi),性激素增加到一定濃度才產(chǎn)生泌香反應(yīng)。本試驗結(jié)果顯示,不同年齡階段的個體睪酮含量在泌香期的各時期均有明顯的變化規(guī)律。正常時期糞樣中睪酮含量較低,到了泌香期前睪酮的含量開始升高,到了泌香期初期,睪酮含量急劇升高,顯著高于正常期(P<0.05),尤其2~7歲林麝還顯著高于泌香期前(P<0.05),在泌香期盛期,睪酮的含量達(dá)到最高峰,顯著高于其它各個時期(P<0.05)。這和許多雄性動物在繁殖期睪酮水平顯著高于非繁殖期是吻合的。泌香盛期,林麝雌二醇的含量也達(dá)到最高峰,除了8~10歲林麝的雌二醇含量與泌香期后期不顯著外,其他顯著高于其它各個時期(P<0.05)。這和梅花鹿茸角生長規(guī)律與體內(nèi)激素關(guān)系的研究結(jié)果也是吻合的。睪酮和雌二醇的含量在雄麝泌