泌香期林不足林的性激素變化規(guī)律

泌香期林不足林的性激素變化規(guī)律

雄性林麝香具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。它被廣泛應(yīng)用于亞洲的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和國際香料行業(yè)。由于市場的巨大需求，人類“殺害麝香并吸取香味”，導(dǎo)致森林砍伐棲息地的嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致該動(dòng)物滅絕。2003年，該書被提升為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。為了科學(xué)而有效地保護(hù)利用這種珍貴的野生動(dòng)物資源,需要對其影響泌香量的性激素進(jìn)行分析研究。性激素的大量研究表明其和動(dòng)物的繁殖有著密切關(guān)系,例如有研究表明小熊貓血清雌二醇、孕酮含量變化直接反映其繁殖規(guī)律;在未受孕的月經(jīng)周期內(nèi),雌性川金絲猴的邀配行為受雌二醇水平的調(diào)控;Asa等報(bào)道,雖圈養(yǎng)狼血清雌二醇水平在發(fā)情前和發(fā)情期增加,但與尿標(biāo)記行為顯著不相關(guān);麋鹿的糞樣性激素水平表現(xiàn)出明顯的季節(jié)變化,雄鹿繁殖行為的發(fā)生頻次與糞樣睪酮水平呈顯著地正相關(guān);非動(dòng)情象尿液中孕酮和雌二醇水平顯著低于受孕象相應(yīng)的激素水平。麝香腺是雄麝的副性征,受雄性激素調(diào)節(jié)和控制,Wisoloski研究表明,將外源雄激素注入正?；蜷幐畹男坌詣?dòng)物體內(nèi)會(huì)提高副性腺的重量和功能。汪建隆等研究表明性激素(促卵泡素FSH與促黃體生成素LH)可以影響麝香分泌。洪沂生等對切除睪丸和附睪的雄麝、失去自然泌香能力的雄麝和非泌香期的雄麝進(jìn)行外源雄性激素的誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)雄麝都會(huì)重新分泌麝香。尹淑媛等進(jìn)一步證明了外源雄性激素可誘導(dǎo)雄麝的泌香活動(dòng)。以上研究結(jié)果表明,性激素LH、FSH、LRH可以影響麝香分泌,丙酸睪丸素、LRH、HCG、LH可以促進(jìn)麝香的分泌。應(yīng)用放射免疫分析法(RIA)測定血液類固醇激素以檢測動(dòng)物繁殖機(jī)能的技術(shù)已得到了廣泛的應(yīng)用,但就珍稀野生動(dòng)物、應(yīng)激強(qiáng)烈的動(dòng)物及難以保定的大家畜而言,該方法的應(yīng)用受到限制。持續(xù)捕捉和靜脈穿刺對動(dòng)物來說就是一種應(yīng)激反應(yīng),會(huì)影響它們的生理狀態(tài)進(jìn)而影響其繁殖機(jī)能。近年來,人們建立了一種以糞樣和尿樣代替血樣,以非侵害性的內(nèi)固醇激素測定來監(jiān)測動(dòng)物的生理繁殖機(jī)能的新方法,得到了廣泛利用,這一技術(shù)長期用于大、中型珍稀哺乳動(dòng)物(如非洲象、大熊貓、鹿、馬來西亞貘、大猩猩、狒狒、大羚羊、牦牛、斑馬等)的研究,在林麝性激素方面的研究主要用來與評(píng)估動(dòng)物青春期的健康狀況、判斷動(dòng)物的排卵方式、早孕診斷、產(chǎn)期預(yù)測等,有關(guān)雄麝糞樣性激素變化與泌香量關(guān)系的研究,至今尚未見報(bào)道。本研究擬采用放射免疫分析法(RIA)對林麝泌香期糞樣中性激素水平進(jìn)行測定,以期分析出雄性林麝泌香期性激素分泌的變化規(guī)律,探究雄性林麝泌香期性激素水平與泌香量的關(guān)系,為提高麝香產(chǎn)量提供科學(xué)依據(jù),具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和學(xué)術(shù)價(jià)值。1材料和方法1.1雄膠囊的年齡分布本研究于2010.04-2011.12在陜西鎮(zhèn)坪縣養(yǎng)麝場進(jìn)行。該麝場創(chuàng)建于1958年,是全國三大野麝家養(yǎng)試驗(yàn)場之一。全場占地總面積80942m2,現(xiàn)存欄社群150只(其中,成年麝88只,仔麝62只)。根據(jù)雄麝年齡與泌香的關(guān)系,把林麝分為以下4個(gè)年齡段:初次泌香階段,1歲(9頭);泌香盛期階段,2~7歲(30頭);泌香下降階段,8~10歲(10頭);泌香少甚至不再泌香階段,10歲以上(1頭)。由于年齡大的林麝泌香少或已不再泌香,屬于淘汰對象,導(dǎo)致該年齡段樣本少。本試驗(yàn)以上述4個(gè)年齡階段健康雄麝共50頭為研究對象,每頭均扎有塑料耳號(hào),有各自獨(dú)立的圈舍空間。1.2雄鱗癌保幼期香腺發(fā)育情況糞樣的收集是在6個(gè)不同時(shí)期進(jìn)行:第一個(gè)時(shí)期為林麝無任何泌香生理反應(yīng)的正常時(shí)期(normal,N,2010.04.05-04.10采樣);第2個(gè)時(shí)期是泌香期前(beforemusk-secretingPeriod,BMSP,2010.04.28-05.05采樣),此期是雄麝泌香生理上的準(zhǔn)備期,香腺分泌細(xì)胞已有特殊的分泌物。第3個(gè)時(shí)期是泌香初期(Primemusk-secretingPeriod,PMSP),雄麝食量開始遞減,睪丸、陰囊腫脹下垂,香腺體積明顯增大,開始分泌少量初香液。第四個(gè)時(shí)期是泌香盛期(vigorousmusk-secretingPeriod,VMSP),雄麝睪丸、陰囊持續(xù)增大腫脹,分泌大量初香液,排入香囊腔,并伴有“拒食”反應(yīng),飲水量也大減,少活動(dòng),多安靜站立。第五個(gè)時(shí)期是泌香后期(latermusk-secretingPeriod,LMSP),雄麝睪丸、陰囊及香腺開始縮小,腫脹消退,進(jìn)食與其他行為逐漸恢復(fù)。第六個(gè)時(shí)期是泌香期后(aftermusk-secretingPeriod,AMSP),是初香液在香囊腔內(nèi)的熟化過程。后面的這幾個(gè)時(shí)期根據(jù)每個(gè)林麝的具體生理、行為特點(diǎn)而進(jìn)行采樣。一般在反應(yīng)次日清晨采集新鮮糞便,將其放入一次性滅菌自封袋中,記錄糞便采集日期、時(shí)間、個(gè)體編號(hào)等,使用冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,-20℃冷凍保存。1.3雄傳統(tǒng)的案外觀雄麝的自然泌香每年1次,出現(xiàn)在5~7月間。麝香是雄麝的肚臍和生殖器之間的腺囊的分泌物。追蹤5歲的雄麝10頭連續(xù)2年的泌香量,記錄數(shù)據(jù)。1.4糞樣中二氯甲烷的制備以李春旺等的方法,改進(jìn)后用來提取糞樣中的激素,具體步驟如下:睪酮和孕酮的提取:將濕糞樣混合均勻,去除石礫和雜物,取2份各稱取1.0g左右,1份120℃烘干后再稱重,測含水量。另1份冷凍干燥后在冰上研磨混勻,取0.5g加入甲醇/蒸餾水(8∶1)的混合液4mL,振蕩10min;再加入2mL石油醚振蕩1min(以除去脂質(zhì)),然后-4℃、4000r/min離心10min,取甲醇層2mL于小試管中,作為待測樣品。按同樣方法取2份糞便。另1份冷凍干燥后在冰上研磨混勻,取0.5g濕糞樣,加3mL二氯甲烷和1.3mL氫氧化鉀(0.1mol/L),振蕩5mim,然后-4℃、2000r/min離心10min,吸去水層,取其二氯甲烷層3mL于另一試管中,用1mL蒸餾水洗該二氯甲烷2次,后取1mL二氯甲烷層于小試管中,使用真空冷凍干燥機(jī)(0℃,12h)對樣品進(jìn)行冷凍干燥。測定雌二醇前,向蒸干待測的小試管中加入0.6mL0.1%的磷酸鹽明膠緩沖液(GPS),振蕩3min,構(gòu)成待測樣品。1.5雙管平行測定用北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的睪酮、雌二醇、孕酮放射免疫分析測定試劑盒對采自雄麝糞樣中的睪酮(T)、雌二醇(E2)、孕酮(P)進(jìn)行雙管平行測定。將各個(gè)濕糞樣的激素含量換算成干糞樣中的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方式為四參數(shù)方程法,R2均接近1。測定的儀器是中國核工業(yè)部西安二六二廠生產(chǎn)的全自動(dòng)十探頭γ免疫計(jì)數(shù)器(XH-6080)。1.6數(shù)據(jù)分析使用MicrosoftExcel2003軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及作圖,采用SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及相關(guān)性分析。2結(jié)果與分析2.1雄液壓時(shí)代的血清睪丸酮含量雄麝不同年齡階段不同時(shí)期睪酮的變化規(guī)律如圖1和表1所示。雄麝各個(gè)不同時(shí)期均表現(xiàn)出規(guī)律性的變化曲線:在無任何泌香生理反應(yīng)的正常時(shí)期,糞樣中睪酮含量最低;泌香期前睪酮的含量開始升高;泌香初期,睪酮含量急劇升高,顯著高于正常期(P<0.05),2~7歲顯著高于泌香期前(P<0.05);泌香盛期,睪酮的含量繼續(xù)升高,達(dá)到最高峰,顯著高于其它各個(gè)時(shí)期(P<0.05);泌香后期睪酮的含量開始下降;泌香期后睪酮的含量繼續(xù)下降。雄麝4個(gè)年齡階段表現(xiàn)出相似的睪酮的含量變化規(guī)律,以2~7歲年齡段睪酮含量最高(3766.82±98.48)ng/g,1歲年齡段睪酮含量最低(2409.68±99.94)ng/g)。在2~7歲年齡段,泌香期初期雄麝睪酮的含量與泌香期前差異顯著(P<0.05),其它年齡段差異均不顯著。2.2泌香期前后雄噴植物群落各年齡的基本成分比較雄麝同一時(shí)期不同年齡階段睪酮含量變化見表2。從表2可以看出,正常期各年齡階段差異不顯著,泌香期前、泌香初期、泌香盛期2~7歲與1歲雄麝睪酮含量差異顯著(P<0.05),泌香盛期8~10歲與1歲雄麝睪酮含量差異不顯著,泌香期后期1歲與2~7、8~10歲雄麝睪酮含量差異顯著(P<0.05),泌香期后各年齡階段差異均顯著(P<0.05)。2.3雄鱗癌組織中二醇含量的變化雄麝雌二醇含量的變化規(guī)律如圖2和表3所示。雄麝各個(gè)不同年齡階段均變現(xiàn)出規(guī)律性變化曲線,在無任何泌香生理反應(yīng)的正常時(shí)期,其糞樣中雌二醇含量較低;泌香期前雌二醇的含量開始升高;泌香初期,雌二醇含量急劇升高,顯著高于正常期(P<0.05),尤其1歲、2~7歲雄麝還顯著高于泌香期前;泌香盛期,雌二醇的含量繼續(xù)升高,達(dá)到最高峰,除了8~10歲雄麝的雌二醇含量與泌香期后期差異不顯著外,顯著高于其它各個(gè)時(shí)期(P<0.05);泌香后期雌二醇的含量開始下降,尤其2~7歲雄麝雌二醇的含量與泌香期初期差異顯著(P<0.05);泌香期后除了1歲雄麝雌二醇的含量出現(xiàn)上升外,其它年齡階段繼續(xù)下降,各個(gè)年齡階段雄麝雌二醇的含量與泌香期前差異不顯著。2.4不同年齡、泌香期、年齡雄鱗行政期后二醇含量的變化雄麝同一時(shí)期不同年齡階段雌二醇含量變化見表4。從表4可以看出,正常期、泌香期初期1歲與2~7歲、8~10歲雄麝雌二醇的含量差異顯著(P<0.05),泌香期后期1歲與8-10歲雄麝雌二醇的含量差異顯著(P<0.05),其它各時(shí)期差異均不顯著。2.5雄鱗癌的泌香情況1歲雄麝糞樣中睪酮、雌二醇含量的規(guī)律性變化如圖3所示,其他2個(gè)年齡階段糞樣中睪酮、雌二醇含量變化曲線圖與1歲雄麝的相似:在正常期睪酮、雌二醇的含量較低,隨后不斷上升,在泌香盛期均達(dá)到最高峰,除1歲雄麝在泌香期后出現(xiàn)上升外,其他2個(gè)年齡段之后不斷下降。由圖可見,雄麝睪酮含量變化迅速,而雌二醇含量水平變化平穩(wěn)。經(jīng)相關(guān)分析得出:雄麝的泌香量與睪酮的含量之間呈顯著強(qiáng)正相關(guān):Y=0.0011X+8.6072(R2=0.6504,P<0.05)。林麝的泌香量與雌二醇的含量之間呈顯著正相關(guān):Y=0.0043X+10.231(R2=0.4565,P<0.05)。2.6生殖動(dòng)物自身含量的變化與睪酮及雌二醇表現(xiàn)出明顯規(guī)律性變化相反,泌香期雄性林麝孕酮的含量未呈現(xiàn)出規(guī)律性變化,主要原因可能是孕酮的變化主要在雌性動(dòng)物妊娠期。孕酮對雄性動(dòng)物生殖活動(dòng)的作用,主要通過生物合成雄激素和雌激素來體現(xiàn),而且孕酮具有一定的周期性、陣發(fā)性、季節(jié)性。3泌香期各階段劃分在動(dòng)物激素水平研究中,一般采用動(dòng)物肌肉和血液樣品進(jìn)行分析,這樣會(huì)影響動(dòng)物正常的內(nèi)分泌水平,干擾動(dòng)物的正常生理狀態(tài),導(dǎo)致測定結(jié)果出現(xiàn)偏差,且對于一些敏感物種而言,強(qiáng)迫性的采樣還會(huì)造成動(dòng)物生理和心理的損傷。野生動(dòng)物數(shù)量少,取樣難度大,這些都給野生動(dòng)物研究帶來很大不便。應(yīng)用糞樣中類固醇激素研究野生動(dòng)物繁殖生物學(xué)主要對于人工圈養(yǎng)或半敞放養(yǎng)的野生動(dòng)物比較實(shí)用。由于動(dòng)物糞樣容易收集,易于保存,對動(dòng)物的影響較小,因此非損傷性采樣在野生動(dòng)物研究中得到了廣泛的應(yīng)用。糞樣分析已經(jīng)用于動(dòng)物的領(lǐng)域、食性、消化動(dòng)態(tài)、疾病與寄生蟲、種群數(shù)量和遺傳結(jié)構(gòu)、有效種群大小、食物鏈與食物網(wǎng)、能量流與物質(zhì)流的研究等方面。在動(dòng)物的研究和保護(hù)中,通過糞樣可以得到許多關(guān)鍵性問題的答案。因此,利用林麝的糞樣研究類固醇激素的變化規(guī)律是切實(shí)可行的,但在采樣過程中應(yīng)注意以下環(huán)節(jié),不同個(gè)體之間在進(jìn)入泌香期時(shí)間前后不一,進(jìn)入泌香期的各階段時(shí)間長短不等,這就需要認(rèn)真觀察其生理、行為反應(yīng)。林麝睪丸、陰囊的形態(tài)變化是反映泌香期的良好指標(biāo)。林麝睪丸開始腫大是泌香期來臨的征兆。隨著林麝睪丸、陰囊腫大的過程,香囊內(nèi)香液逐漸增加,又隨著睪丸、陰囊腫大的消退,香囊內(nèi)香液逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轺晗?。林麝泌香期結(jié)束,睪丸、陰囊也恢復(fù)原狀。而林麝采食行為的急劇變化—減食、停食則是其進(jìn)入泌香盛期的顯著標(biāo)志。林麝進(jìn)入泌香期的各階段劃分,除了依據(jù)生理反應(yīng),還應(yīng)根據(jù)糞樣的顏色、氣味、濕干程度進(jìn)行確定。故本方法適用于珍稀野生動(dòng)物、應(yīng)激強(qiáng)烈的動(dòng)物及難以保定的大家畜的類固醇激素研究,具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。睪酮的生理作用主要為促進(jìn)雄性生殖器官的發(fā)育和第二性征的出現(xiàn),促進(jìn)精子的發(fā)生與成熟,刺激并提高雄性性欲等。睪酮還與雄性的交配行為和社會(huì)行為密切相關(guān)。雌激素對雄性動(dòng)物的生殖活動(dòng)主要表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。大劑量雌激素可引起雄性胚胎雌性化,并對雄性第二性征和性行為發(fā)育有抑制作用。泌香機(jī)能是雄麝特有的生理機(jī)能,麝香囊及香腺是雄麝獨(dú)具的副性征。動(dòng)物體中,副性征的活動(dòng)受雄性激素的調(diào)節(jié)是普遍規(guī)律?？梢?性激素與麝泌香的關(guān)系十分密切,在雄麝體內(nèi),性激素增加到一定濃度才產(chǎn)生泌香反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,不同年齡階段的個(gè)體睪酮含量在泌香期的各時(shí)期均有明顯的變化規(guī)律。正常時(shí)期糞樣中睪酮含量較低,到了泌香期前睪酮的含量開始升高,到了泌香期初期,睪酮含量急劇升高,顯著高于正常期(P<0.05),尤其2~7歲林麝還顯著高于泌香期前(P<0.05),在泌香期盛期,睪酮的含量達(dá)到最高峰,顯著高于其它各個(gè)時(shí)期(P<0.05)。這和許多雄性動(dòng)物在繁殖期睪酮水平顯著高于非繁殖期是吻合的。泌香盛期,林麝雌二醇的含量也達(dá)到最高峰,除了8~10歲林麝的雌二醇含量與泌香期后期不顯著外,其他顯著高于其它各個(gè)時(shí)期(P<0.05)。這和梅花鹿茸角生長規(guī)律與體內(nèi)激素關(guān)系的研究結(jié)果也是吻合的。睪酮和雌二醇的含量在雄麝泌