卵巢低反應(yīng)患者抗苗勒管激素和干細胞生長因子表達情況及相關(guān)性研究

卵巢低反應(yīng)患者抗苗勒管激素和干細胞生長因子表達情況及相關(guān)性研究

在超促卵期，低卵反應(yīng)的發(fā)生率約為9%24%?？姑缋展芗に?anti-mullerianhormone,AMH)屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族成員之一,主要由竇前和小竇卵泡的顆粒細胞產(chǎn)生,在閉鎖卵泡和卵泡膜細胞無表達,可有效抑制卵泡的募集,調(diào)控卵子的生長和發(fā)育。研究認(rèn)為,在卵巢低反應(yīng)患者血清、卵泡液及顆粒細胞中AMH表達顯著降低,預(yù)測卵巢反應(yīng)性的價值優(yōu)于卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、抑制素等指標(biāo)。既往對卵巢低反應(yīng)的研究主要集中于尋找可以預(yù)測、評判卵巢反應(yīng)的指標(biāo)。然而關(guān)于卵巢低反應(yīng)病因尚不清楚,關(guān)于其機制研究甚少。而干細胞生長因子(stemcellfactor,SCF)是一種多功能的細胞因子,參與機體多種細胞的增殖及發(fā)育過程,在卵巢的顆粒細胞、卵泡膜細胞和膜間質(zhì)細胞均能表達,其在始基卵泡募集、發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。文獻研究表明,在卵泡募集生長過程中AMH和SCF均是重要的調(diào)控因子。本研究以卵巢低反應(yīng)患者為研究對象,收集并測定132例卵巢低反應(yīng)患者和91例正常對照者血清、卵泡液及顆粒細胞中AMH、SCF的表達情況,探討顆粒細胞中AMH和SCF表達的相關(guān)性,為研究卵巢低反應(yīng)患者發(fā)病機制提供理論依據(jù)。1對象和方法1.1引物篩選及單精子注射目前關(guān)于卵巢低反應(yīng)尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)2011年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(ESHRE)對卵巢低反應(yīng)診斷做出的規(guī)范(博洛尼亞標(biāo)準(zhǔn))選擇研究樣本。收集2011年4月至2013年9月在寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診行體外受精-胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer,IVF-ET)或卵細胞漿內(nèi)單精子注射(intra-cytoplasmicsperminjection,ICSI)的卵巢低反應(yīng)患者132例(卵巢低反應(yīng)組)和正常者91例(正常對照組)。入選研究對象均測量其身高、體重,計算體重指數(shù)(BMI)。根據(jù)博洛尼亞標(biāo)準(zhǔn)和研究目的的需要將年齡小于35歲并同時滿足以下兩個條件的患者列為卵巢低反應(yīng)組:①既往有卵巢低反應(yīng)(poorovarianresponse)史,常規(guī)促排卵方案獲卵數(shù)≤3個;②卵巢儲備功能降低:竇卵泡數(shù)小于7個。正常對照組的篩選標(biāo)準(zhǔn)為:卵巢功能正常、無多囊卵巢綜合征(PCOS)、無卵巢不良反應(yīng)史、無子宮內(nèi)膜異位癥或其他內(nèi)分泌疾病,只因男方因素行IVF-ET并年齡小于35歲者。1.2方法1.2.1離心置管及待測①血清:收集每例受試者月經(jīng)周期第3天空腹靜脈血4ml,1500r/min,5分鐘離心后取上清分裝至0.5ml的EP管,保存于-20℃冰箱待測。②卵泡液:收集每例受試者所需卵泡的卵泡液15ml于無菌離心管中,1500r/min,10分鐘離心后留上清分裝至EP管,保存于-20℃冰箱待測。③顆粒細胞的分離:光學(xué)顯微鏡下剝離所取卵周圍的顆粒細胞團,600r/min離心5分鐘,用40%Percoll液去除沉淀物中的紅細胞,0.2g/L的Ⅰ型膠原酶消化顆粒細胞的白膜層30分鐘,將所取的細胞懸液與等量體積分?jǐn)?shù)40%Percoll液再次離心后,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌1次,經(jīng)臺盼藍染色證明存活率>75%的顆粒細胞按1×106/ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板,置37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待測顆粒細胞中AMHmRNA和SCFmRNA的相對含量。1.2.2檢測方法1.2.2.elisa法測血清和泡液中其各清液濃度分別采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)和電化學(xué)發(fā)光法(ECLIA)檢測血清和卵泡液中FSH、黃體生成素(LH)、E2、催乳激素(PRL)、睪酮(T)的濃度,均按試劑盒的說明進行操作。批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均<5%。該試劑盒由廈門慧嘉生物科技有限公司提供,所有的操作均嚴(yán)格按產(chǎn)品說明進行。采用ELISA測定血清和卵泡液中二者的濃度。具體操作如下:將血清及卵泡液標(biāo)本置于37℃恒溫箱融化備用,標(biāo)記所需的反應(yīng)板。①在相應(yīng)的孔中加入100μl緩沖液,分別加入20μl待測樣本、質(zhì)控及標(biāo)準(zhǔn)品,700r/min的速度振蕩,室溫孵育1小時;②洗液洗板30秒共6次,拍干后,加入100μl抗體-生物素結(jié)合物溶液,以700r/min的速度振蕩,室溫孵育1小時;③再次洗液洗板30秒共6次,拍干后加入100μl酶結(jié)合物溶液,700r/min的速度振蕩,室溫孵育30分鐘;⑥洗液洗板30秒共6次,洗完后在吸水材料上拍干后檢測實驗標(biāo)本。AMH和SCF檢測試劑盒均由廈門慧嘉生物科技有限公司提供。1.2.2.amh和scf的mrna表達分析用Trizol(Invitrogen)提取細胞組織中的總RNA,通過RT-PCR轉(zhuǎn)錄AMH和SCF目的基因,進而檢測顆粒細胞中AMHmRNA和SCFmRNA的相對含量,兩者的表達相對灰度值=AMH(SCF)mRNA/ActinmRNA。PCR的反應(yīng)條件見表1。1.3資料統(tǒng)計與統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布,以ue0af±s表示。采用t檢驗及Pearson相關(guān)性分析對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1gn用量、fsh、gn用量對fsh、gn及卵巢數(shù)、獲卵數(shù)的影響對兩組患者臨床及生化指標(biāo)進行檢測,由表2可見,卵巢低反應(yīng)組E2和FSH顯著升高,Gn用量顯著增加,平均卵泡數(shù)、卵巢體積顯著減少,獲卵數(shù)顯著減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01;P<0.05)。兩組間年齡、BMI比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2.2h蛋白表達與正常對照組比較,卵巢低反應(yīng)組中血清、卵泡液AMH蛋白表達均顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01;P<0.05);SCF蛋白的表達無明顯變化,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。2.3兩組均對amphonea和scfmnmnat檢查及相關(guān)分析進行了相關(guān)性分析2.3.1r1提取2.3.2兩組rt-pcr產(chǎn)物的電泳分析卵巢低反應(yīng)組顆粒細胞中SCFmRNA的表達較對照組明顯增強,而AMHmRNA的表達較對照組明顯下降,見圖2。2.3.3scfm-na表達情況卵巢低反應(yīng)組中AMHmRNA表達相對灰度值較正常對照組顯著降低(P<0.01),而SCFmR-NA表達相對灰度值較正常對照組明顯增加(P<0.05)。見表4。2.3.4amhmna和scfmna的表達相關(guān)性分析由表4可見,卵巢低反應(yīng)患者顆粒細胞中AMHmR-NA和SCFmRNA的表達與正常對照組的表達趨勢截然相反,對卵巢低反應(yīng)患者顆粒細胞中AMHmRNA和SCFmRNA的表達進行相關(guān)性分析,可見卵巢低反應(yīng)患者顆粒細胞中AMHmRNA和SCFmRNA的表達呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.56,P<0.05)。見圖3。3討論3.1amh在女性正常組織中的表達與卵巢反應(yīng)特性及含量AMH屬于TGF-β超家族成員之一,是由二硫鍵連接而成的糖蛋白二聚物,僅限于性腺表達的激素。主要表達于早期生長卵泡、竇卵泡和小竇卵泡的顆粒細胞中。本研究通過檢測與卵巢反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn):卵巢低反應(yīng)組血清基礎(chǔ)FSH、E2水平明顯升高,平均卵巢體積及卵泡數(shù)顯著減少。近年Kalaiselvi等的研究發(fā)現(xiàn),育齡期婦女血清中AMH與FSH、基礎(chǔ)卵泡數(shù)和卵巢體積等指標(biāo)相比較,能更好地預(yù)測卵巢反應(yīng)潛能,并且發(fā)現(xiàn)AMH的表達水平與女性的生育力密切相關(guān),在生育力相對低下的女性組,血清中AMH的水平明顯降低。從青春早期至整個性成熟期均可在血清中檢測出AMH,血清AMH濃度可以反映始基卵泡池的大小并能夠作為卵巢儲備功能的標(biāo)志物,預(yù)測卵巢的反應(yīng)性。Knauff等發(fā)現(xiàn),在卵巢早衰的初始階段,患者月經(jīng)周期規(guī)律而卵泡期FSH升高,25%的患者出現(xiàn)血清AMH水平較正常對照組下降5%,7%患者血清中無法檢測到AMH;在卵巢早衰的轉(zhuǎn)變期,患者月經(jīng)周期紊亂,66%的患者血清AMH水平明顯下降,52%患者血清中無法檢測到AMH。本實驗為了排除年齡對實驗結(jié)果的影響,均選擇小于35歲的女性不孕患者,本研究及課題組前期實驗結(jié)果均發(fā)現(xiàn),卵巢低反應(yīng)組血清中AMH表達水平較對照組顯著降低(P<0.01),與Kalaiselvi等和Knauff等國外學(xué)者研究結(jié)果一致。為了更全面研究AMH,本研究同時檢測了卵泡液及顆粒細胞中AMH的表達水平,發(fā)現(xiàn)AMH在卵巢低反應(yīng)患者顆粒細胞和卵泡液中的表達均顯著下降;進一步證實AMH的表達水平與卵巢反應(yīng)性息息相關(guān),是評價卵巢反應(yīng)潛能的良好指標(biāo)。但是目前關(guān)于其病因及機制的研究文獻報道甚少,有待進行更深入的研究。3.2amh和scf在卵巢低反應(yīng)患者中的表達變化SCF又稱肥大細胞生長因子,屬多肽類物質(zhì),是酪氨酸激酶受體的配體(KL),是卵泡顆粒細胞、卵泡膜細胞和膜間質(zhì)細胞均能表達的多功能細胞因子。眾多研究證實,SCF在卵泡的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用,尤其在早期的卵泡發(fā)育階段,起著關(guān)鍵的誘導(dǎo)作用。文獻研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)的卵巢組織經(jīng)SCF重組體干預(yù)后,生長期卵泡所占比例明顯增加,提示SCF是促進卵子生長的關(guān)鍵因子;而經(jīng)AMH重組體干預(yù)后,SCF促進卵子生長的作用消失,生長期卵泡所占比例明顯減少,提示AMH可能具有抑制SCF促進卵子生長的作用。卵巢組織中二者的關(guān)系密切,本實驗以卵巢低反應(yīng)患者為研究對象,初步檢測132例卵巢低反應(yīng)患者血清和卵泡液AMH和SCF的表達,實驗結(jié)果顯示,AMH在卵巢低反應(yīng)患者卵泡液和血清中的表達顯著降低,而SCF的表達較正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,僅有上升的趨勢;而對顆粒細胞中SCF的表達進行檢測發(fā)現(xiàn),卵巢低反應(yīng)患者顆粒細胞中SCF表達相對灰度值顯著升高,AMH表達相對灰度值明顯降低,這可能與顆粒細胞直接分泌SCF和樣本量有關(guān)。結(jié)合上述國內(nèi)外研究結(jié)果,提示在卵巢低反應(yīng)患者中,兩種因子之間可能存在著某種關(guān)聯(lián),應(yīng)對其進行較為深入的研究。因AMH和SCF都是卵巢顆粒細胞分泌,故本研究以顆粒細胞為載體,在細胞水平探討二者的關(guān)系,對卵巢低反應(yīng)患者中AMHmRNA與SCFmRNA的表達及相關(guān)性進行研究,研究結(jié)果顯示,卵巢低反應(yīng)患者顆粒細胞中二者的表達呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.56,P<0.01),提示二者在顆粒細胞可能存在調(diào)控的關(guān)系。近來Do