花梨木改善小鼠抑郁樣行為的機(jī)制研究

花梨木改善小鼠抑郁樣行為的機(jī)制研究

隨著現(xiàn)代計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展，經(jīng)絡(luò)感知通道已成為控制和預(yù)防神經(jīng)疾病的新目標(biāo)通道，對(duì)患有抑郁、精神分裂癥、老年輕視和其他疾病有良好的預(yù)防和效果。目前抑郁癥的治療主要是5-羥色胺再攝取抑制劑,但藥物不良反應(yīng)大,患者長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生耐受等問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明,某些芳香物質(zhì)如香草醛及丁香酚可以通過(guò)嗅覺(jué)通路作用于大腦相關(guān)區(qū)域,改善記憶功能;另有文獻(xiàn)報(bào)道,某些芳香物質(zhì)可以通過(guò)嗅覺(jué)通路改善抑郁癥狀,但機(jī)制不詳。本研究在此采用慢性不可預(yù)知性中等強(qiáng)度刺激(CUMS)動(dòng)物模型并結(jié)合芳香物質(zhì)花梨木精油通過(guò)嗅覺(jué)通路吸嗅給藥的方法來(lái)觀察抑郁小鼠神經(jīng)行為學(xué)的改變,并用形態(tài)學(xué)的方法探討其可能的機(jī)制,增加對(duì)抑郁癥發(fā)生的認(rèn)識(shí)和理解。材料和方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)備48只健康C57BL/6小鼠,雄性,每組12只,體重15-25g,2個(gè)月齡(購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。電子天平,JA21001型9(上海精科天平廠);懸尾實(shí)驗(yàn),仿文獻(xiàn)自制;強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),仿文獻(xiàn)自制;Leica石蠟切片機(jī),RM2135型(德國(guó));切片漂烘溫控儀,QP-B型(安徽電力科學(xué)研究所);攝片顯微鏡,Nikon80i型(日本)。二、方法1.抑郁癥模型的制作48只C57BL/6小鼠置于安靜、室溫(25±1)℃、自然光照的實(shí)驗(yàn)室中單籠飼養(yǎng),自由飲水及攝食,飼養(yǎng)1周。參照文獻(xiàn)采用CUMS+孤養(yǎng)方法制作抑郁癥模型。以下刺激方式以每天1次的頻率隨機(jī)交替小鼠應(yīng)激21d,應(yīng)激源包括:禁食24h,禁水24h,45℃熱刺激3min,4℃冷刺激3min,懸吊15min,夾尾90s,晝夜顛倒24h。建模成功的標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)過(guò)3周CUMS之后,小鼠的懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間顯著高于應(yīng)激前,24h糖水消耗量顯著低于應(yīng)激前,剔除應(yīng)激前后數(shù)值變化低于總數(shù)均數(shù)10%的小鼠。2.抑郁癥狀的測(cè)定將48只小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、CUMS組、CUMS+花梨木精油吸嗅組(花梨木組)、CUMS+鹽酸氟西汀組(百憂解組)。花梨木組給予花梨木精油吸嗅,吸嗅方法參考文獻(xiàn),百憂解組用百憂解灌胃,按3.33mg·kg-1·d-1給藥。在吸嗅2、3、4周時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行抑郁癥獲得性無(wú)助行為評(píng)分,以了解抑郁癥緩解情況。在獲得性無(wú)助行為緩解之后對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行24h糖水消耗量測(cè)定,以綜合評(píng)價(jià)抑郁癥的緩解情況。3.神經(jīng)學(xué)(1)樹(shù)脂玻璃箱的配制動(dòng)物尾部遠(yuǎn)端1.5cm處固定后懸掛于40cm×40cm×40cm的白色樹(shù)脂玻璃箱中,距地面15cm。記錄6min內(nèi)的第2-6分鐘的不動(dòng)時(shí)間總和。(2)強(qiáng)制游泳實(shí)驗(yàn)參考Porsolt等方法,記錄6min內(nèi)的第2-6分鐘的不動(dòng)時(shí)間總和。(3)24小時(shí)糖消費(fèi)實(shí)驗(yàn)將每只小鼠的飲水瓶?jī)?nèi)加入1%的蔗糖溶液100ml,同時(shí)進(jìn)行禁食,計(jì)算小鼠在24h內(nèi)飲用1%的蔗糖溶液量。4.層面切片片型行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后處死動(dòng)物,4%多聚甲醛灌注固定,取腦組織,石蠟包埋,連續(xù)冠狀層面切片,片厚5μm。切片脫蠟,水化,免疫組化SABC法染色,0.01M檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)抗原,一抗為單克隆兔抗小鼠多巴胺2型受體(DAR2),二抗為生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG,顯微鏡下觀察多巴胺(DA)表達(dá)情況,并采集圖像。三、方差分析方法采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較時(shí),若方差齊時(shí),采用SNK檢驗(yàn);若方差不齊,采用Games-Howell檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、小鼠在吸嗅治療2、3和4周時(shí)懸尾的靜力與CUMS組比較,花梨木組和百憂解組小鼠在吸嗅治療2、3和4周時(shí)的懸尾安靜和強(qiáng)迫游泳時(shí)間均明顯縮短,而糖水消耗量明顯增加(P<0.05)(表1-3)。二、小鼠杏仁核、海馬、瞳仁斷、未固結(jié)反應(yīng)內(nèi)da的表達(dá)免疫組化結(jié)果經(jīng)圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示,與CUMS組相比,花梨木組與百憂解組小鼠的杏仁核(見(jiàn)封二圖1)、海馬(見(jiàn)封二圖2)、下丘腦(見(jiàn)封二圖3)內(nèi)DA的表達(dá)明顯升高。抑郁癥患者花梨木精油的作用嗅覺(jué)與抑郁癥關(guān)系密切,嗅覺(jué)與情緒也有聯(lián)系,嗅覺(jué)中樞如下丘腦、海馬、杏仁核與抑郁癥關(guān)系密切,參與抑郁癥的發(fā)生、病理過(guò)程。芳香物質(zhì)丁香酚可以通過(guò)與鼻腔黏膜的嗅上皮上存在的特異性嗅覺(jué)受體神經(jīng)元(ORN)上特異性G蛋白偶聯(lián)受體相結(jié)合,通過(guò)環(huán)磷酸腺苷激活ORN上的離子通道,從而產(chǎn)生嗅覺(jué)感受器電位,這個(gè)電位可通過(guò)ORN的軸突傳遞至嗅球中特異性的嗅小球,而嗅小球可通過(guò)僧帽細(xì)胞與簇細(xì)胞的二級(jí)軸突形成的嗅覺(jué)通路到達(dá)腦的特異性腦區(qū),如嗅前核、下丘腦、梨狀前皮質(zhì)、杏仁核、內(nèi)側(cè)嗅皮質(zhì)、海馬。本研究行為學(xué)結(jié)果顯示,花梨木精油吸嗅能夠緩解小鼠的抑郁樣行為,表明花梨木精油干預(yù)的有效性?；ɡ婺揪陀墟?zhèn)靜、收斂、穩(wěn)定的特性,可以鎮(zhèn)定中樞神經(jīng)系統(tǒng),緩解抑郁。免疫組化結(jié)果顯示,花梨木組和百憂解組在杏仁核區(qū)產(chǎn)物較多,推測(cè)杏仁核參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。國(guó)外研究表明,杏仁核是控制情感最重要的腦區(qū),但其中樞的機(jī)制還不很清楚。杏仁核在多巴胺能系統(tǒng)活動(dòng)中起到主要的作用,而情緒的調(diào)節(jié)與多巴胺能系統(tǒng)有直接的聯(lián)系。研究表明,杏仁核和額皮質(zhì)能夠調(diào)節(jié)情感過(guò)程,由此表明,杏仁核能夠介導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。神經(jīng)影像學(xué)的研究論證了杏仁核在情感記憶中發(fā)揮了重要的作用,杏仁核可以直接調(diào)節(jié)情緒記憶或者通過(guò)海馬的調(diào)制來(lái)實(shí)現(xiàn)。免疫組化結(jié)果顯示,在海馬和下丘腦區(qū)花梨木組也較對(duì)照組多,海馬與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。抑郁癥可以引起動(dòng)物行為學(xué)的異常、神經(jīng)遞質(zhì)的變化、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的改變。抑郁癥發(fā)病機(jī)制主要是單胺學(xué)說(shuō),DA、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素與抑郁癥關(guān)系密切。DA能夠調(diào)節(jié)人類杏仁核和前額皮質(zhì)的活動(dòng),臨床研究表明,抑郁癥患者的腦內(nèi)DA、5-HT等含量減少,這與本研究免疫組化結(jié)果相一致。本研究利用芳香物質(zhì)通過(guò)吸嗅的方式到達(dá)嗅球,再到達(dá)嗅覺(jué)