白芥子涂法巴布劑處方優(yōu)化及其對哮喘大鼠的預防作用

白芥子涂法巴布劑處方優(yōu)化及其對哮喘大鼠的預防作用

哮喘是由各種細胞，尤其是脂肪細胞、嗜酸性粒細胞和t淋巴結引起的慢性呼吸道炎癥。在易受影響的患者中，這種炎癥可能會導致哮喘、氣短、胸悶和咳嗽，通常發(fā)生在夜間和閑暇時間。近年來,世界上許多國家的哮喘病率和死亡率有上升趨勢,我國哮喘的患病率約為1%,兒童可達3%,全世界約有1億哮喘病患者,已經(jīng)成為嚴重威脅公眾健康的一種主要慢性疾病。尤其近年在國內經(jīng)常出現(xiàn)持續(xù)的大面積霧霾天氣,使呼吸道疾病患病率逐漸上升,有效治療哮喘、提高生活質量刻不容緩。外敷法治療哮喘的藥物多以清代名醫(yī)張璐的《張氏醫(yī)通》所記載的“白芥子涂法”為基礎制成?！鞍捉孀油糠ā敝械乃幬镏饕獮榘捉孀印⒀雍?、甘遂、細辛、生姜等,將這些藥物搗碎后,用生姜汁調成糊狀,貼于人體的肺俞等穴位處,利用人體在三伏天陽氣旺盛,氣血浮于表,皮膚松弛,毛孔張開等特點,加快藥物透皮吸收從而達到較好的治療效果。其中白芥子可利氣豁痰,溫中散寒,通絡止痛;延胡索可活血、利氣、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜;甘遂有瀉水逐飲、消腫散結的作用;細辛可祛風散寒,治療痰飲咳逆、風濕痹痛;生姜可散寒發(fā)汗,化痰止咳,和胃止嘔。本方一方面可刺激穴位,疏通經(jīng)絡,調理氣血,協(xié)調陰陽抗御病邪;另一方面,特定藥物在特定穴位被吸收,能充分發(fā)揮藥理作用。巴布劑(cataplasm)系指將藥材提取物、藥材或化學藥物與適宜的親水性基質混合均勻后,涂布于背襯材料上制成的貼膏劑。巴布劑具有給藥劑量準確、血藥濃度穩(wěn)定、藥量可控并緩釋、載藥量大、透皮效果好、無刺激、患者順應性好等優(yōu)點;同時,不含傳統(tǒng)膏藥所特有的黃丹、香油等物質,不會產生鉛中毒、皮膚過敏等不良反應。上海雷允上藥業(yè)的“復方紫荊消傷膏”是國內第一個獲得新藥證書的巴布劑產品。本研究采用現(xiàn)代制劑工藝與傳統(tǒng)的外敷法治哮喘處方相結合,制備平喘巴布劑,系統(tǒng)研究了有效成分提取、巴布劑基質篩選、中藥復方巴布劑制備及性質考察、藥效學評價,為哮喘防治提供一種新型中藥復方巴布劑。用現(xiàn)代新型制劑技術模擬三伏貼防治哮喘是中藥現(xiàn)代化的具體體現(xiàn)。1實驗試劑與儀器甘油(西隴化工股份有限公司,批號124152);聚乙二醇400(南京威爾化工有限公司,批號20120524);無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司,批號20131114);甘羥鋁(陜西太白山制藥有限責任公司,批號20130302);檸檬酸(國藥集團化學試劑有限公司,批號T20100913);羧甲基纖維素鈉(中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑有限公司,批號F20030626);聚丙烯酸鈉(國際特品,批號231770A);白芥子、延胡索、甘遂、細辛均購自安徽省亳州市中藥材市場;氮酮(北京化學試劑公司,批號010619);無紡布(浙江弘揚無紡新材料有限公司);隔離膜(佛山蘭迪膠粘材料廠);蒸餾水,生姜油(由本所天然藥物化學課題組提供);SD大鼠(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心,動物合格證號SCXK-(軍),雌雄各半,140~160g)。電熱套(黃驊市新興電器廠,型號ZDHW);電動測試儀(上海鍇凱科技貿易有限公司,型號DG-2000A);小型實驗用涂布機(上海鍇凱科技貿易有限公司,型號TB-0612B);電熱鼓風干燥箱(上海-恒科學儀器有限公司,型號DZF-150);冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司,型號FD-1-55);電子天平(余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司,型號JM-B2002);電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司,型號BS110S)。2方法和結果2.1白色基質篩選2.1.1空白基質的制備空白基質各組分初始質量比為:甘油-水-乙醇-聚乙二醇400(PEG400)-氫氧化鋁-檸檬酸-羧甲基纖維素鈉-聚丙烯酸鈉-聚維酮2∶8∶0.8∶0.4∶0.15∶0.15∶0.15∶0.5∶0.015。稱取處方量甘油、乙醇、PEG400加入同一燒杯中,低速攪拌下分別加入處方量聚丙烯酸鈉、聚維酮K30和羧甲基纖維素鈉,攪拌均勻后作為A相;稱取處方量氫氧化鋁和檸檬酸,加入一定量水中,攪拌均勻后作為B相,攪拌條件下將A相和B相混合均勻即得空白基質。將配制好的空白基質倒入試驗用小型涂布機中制備巴布劑,放入40℃恒溫干燥箱中熟化1h,取出后室溫放置成型,即得空白巴布劑成品。2.1.2傳感器運動極值的測定—評價指標初黏力:初黏力是指物品的表面黏著力。測定方法為:將巴布劑剪成合適大小,除去隔離層后貼于電動測試儀(圖1A)上方的臺面上,在巴布劑上放置一個100g砝碼,將傳感器感應頭朝上,調整上限位,使測頭剛好將砝碼頂起(不可頂翻),停留5s后,感應頭自動向下移動,到達下限位后,停止移動,按下傳感器的“PEAK”鍵,可得到傳感器向下運動的極值,此極值作為初黏力值(單位N),重復3次,求平均值。剝離強度:剝離強度是指物體對另一個表面的附著力。測定方法為:將巴布劑剪成4cm×10cm大小,揭除隔離膜后,室溫平衡2h,將其黏于潔凈的不銹鋼板上,用2kg輥筒來回滾壓3次,放置20min。將不銹鋼板豎直放置(圖1B),將巴布劑上方剝離呈180°翻轉后接一220g重物,記錄巴布劑從鋼板剝離的時間(單位s)。重復3次,求平均值。人體感官評價:隨機選取6人,于手腕內側貼敷相同面積巴布劑(2cm×2cm),按所述指標進行人體感官評價(表1)。2.2單因素白色基質處方的分析2.2.1布布劑含膏量的測定由于巴布劑涂布厚度直接決定了其含膏量(一般不少于0.1g·cm-2),因此通過測定巴布劑含膏量的方法,確定巴布劑涂布厚度。按已有處方制備不同涂布厚度的空白巴布劑,參考2010年版《中國藥典》一部附錄Ⅱ中含膏量測定第二法測定。將不同厚度巴布劑各取1片,除去蓋襯,精密稱定,置燒杯中,加水適量,加熱煮沸至背襯與膏體分離后,取出背襯,用水洗滌至背襯無殘留膏體,揮去溶劑,在105℃烘干箱中30min,然后移至干燥器中,冷卻30min,精密稱定,減失質量即為膏重,按標示面積換算成100cm2的含膏量(表2)。當涂布厚度為2.80,3.00mm時,其含膏量均大于0.1g·cm-2?？紤]到巴布劑載藥量,將涂布厚度暫定為3.00mm。2.2.2巴布劑基質評價固定其他條件,選擇氫氧化鋁、甘羥鋁、氯化鋁作為交聯(lián)劑,制備空白巴布劑基質,評價其外觀。以氫氧化鋁為交聯(lián)劑,基質黏性小,流動性大,氣泡較少;以甘羥鋁為交聯(lián)劑,基質黏性大,流動性較小,氣泡少;以氯化鋁為交聯(lián)劑,基質分層,無黏性。因此確定甘羥鋁為交聯(lián)劑。2.2.3基質的制備固定其他條件,根據(jù)基質涂布時延展性和人體感官評價結果,優(yōu)化甘羥鋁最佳用量。稱取甘油10g,水40g,乙醇4g,PEG4002g,聚丙烯酸鈉5g,檸檬酸0.75g,PVPK300.075g,CMC-Na0.75g,甘羥鋁用量分別為0.25,0.35,0.50,0.75g,按2.1.1項下方法制備成基質。甘羥鋁用量為0.50,0.75g時,無法均勻涂布;當甘羥鋁用量為0.25,0.35g時,可均勻涂布于無紡布上,進一步進行其人體感官學評價。最終確定甘羥鋁用量為0.35g(表3)。2.2.4關于聚苯鈉的劑量研究固定其他條件,根據(jù)人體感官評價結果,優(yōu)化聚丙烯酸鈉最佳用量。最終確定聚丙烯酸鈉用量為5g(表4)。2.2.5篩選最佳黏合劑固定其他條件,以人體感官評價作為指標,篩選最佳黏合劑:PVP-K30,明膠和CMC-Na(表5)。最終確定CMC-Na作為黏合劑。2.2.6正交實驗結果以甘油(A,用量分別為15,20,25g)、檸檬酸(B,用量分別為1.0,1.5,2.0g)、CMC-Na(C,用量分別為1.0,1.5,2.0g)作為影響因素,以初黏力(單位:N)、剝離強度(單位:s)和人體感官評分結果為考察指標,設計L9(34)正交實驗優(yōu)化處方(表6)。由初黏力直觀分析結果可知,各因素對巴布劑初黏力影響順序為:甘油>檸檬酸>CMC-Na,最優(yōu)處方為A3B3C1。由剝離強度直觀分析結果可知,各因素對巴布劑剝離強度的影響順序為:CMC-Na>甘油>檸檬酸,最優(yōu)處方為A2B2C1。隨甘油和檸檬酸用量增加,巴布劑初黏力也逐漸增加,因此確定最優(yōu)處方為A2B2C1,即甘油用量為20g,檸檬酸用量為1.5g,CMC-Na用量為1.0g。最終確定最優(yōu)空白巴布劑基礎處方質量比為:甘油-水-乙醇-PEG400-甘羥鋁-檸檬酸-羧甲基纖維素鈉-聚丙烯酸鈉2∶8∶0.8∶0.4∶0.07∶0.15∶0.1∶0.5。2.3中藥有效提取物的提取2.3.1提取液-液法將處方量白芥子-延胡索-甘遂(2∶2∶1)粉碎成粗粉,裝入1000mL圓底燒瓶內,置于電熱套中,加入8倍量60%乙醇-水溶液,連接回流裝置,保持微沸1h后,倒出提取液,再向圓底燒瓶中加入8倍量60%乙醇水溶液,加熱回流1h,合并2次提取液。將提取液轉入茄型瓶中,70℃減壓濃縮,將濃縮液分裝在100mL燒杯中(不超過燒杯1/5),于-20℃冷凍。冷凍干燥24h后得到有效成分干粉。2.3.2揮發(fā)油提取器、世界如何加熱根據(jù)2010年版《中國藥典》一部附錄XD“揮發(fā)油測定法”中的甲法提取:取細辛適量置于1000mL圓底燒瓶中,加水適量與玻璃珠數(shù)粒,振搖混合后,連接揮發(fā)油提取器和回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油提取器的刻度部分,并溢入燒瓶為止。用電熱套緩慢加熱,保持微沸5h,直至測定器中油量不再增加,停止加熱。放置片刻,打開測定器下端活塞,將水緩緩放出,至油層上端到達0線上面5mL處止。放置1h,開啟活塞使油層下降至其上端恰好與0線齊平,讀取揮發(fā)油量,收集揮發(fā)油備用。2.4含藥巴布劑基質的制備稱取甘油40.0g、無水乙醇16.0g、PEG-4008.0g于300mL燒杯中,稱取聚丙烯酸鈉10.0g、CMC-Na2.0g、細辛揮發(fā)油0.225mL、氮酮2.5g(為基質總質量的1%)和生姜油適量加入上述燒杯中,攪拌均勻作為A相;稱取甘羥鋁1.4g、檸檬酸3.0g、有效成分干粉10g于200mL燒杯中,加入蒸餾水160mL,攪拌均勻作為B相;將B相緩慢加入A相,沿同一方向緩慢攪拌均勻得到含藥巴布劑。同法制備空白巴布劑基質和有效成分干粉量分別為10.0,30.0,50.0g的載藥巴布劑(有效成分質量分數(shù)分別為4%,11%,17%),將上述巴布劑基質倒入涂布機儲料槽中,涂布于無紡布上,并被覆隔離膜。放置熟化成型,得巴布劑成品。2.5有效成分干法量對巴布劑品質指標的影響依上法制備空白及載藥巴布劑,測定其初黏力、剝離強度及人體感官評價指標(表8)。隨有效成分干粉量增多,巴布劑總體感官評價不斷變優(yōu),初黏力和剝離強度也逐漸增大。因此確定治療哮喘用中藥復方巴布劑含藥量為:每100g巴布劑中含藥量為17g(17%)。2.6中藥復方巴布劑對哮喘大鼠模型的建立取SD大鼠25只,隨機分為5組,每組5只:陰性對照組、陽性對照組(三伏貼,北京中西醫(yī)結合醫(yī)院院內制劑)、17%含藥量組、11%含藥量組、4%含藥量組中藥復方巴布劑。建立哮喘大鼠模型,具體操作如下(圖2)。17%含藥量組中藥復方巴布劑對哮喘模型大鼠的撓鼻時間有顯著抑制作用(P=0.037<0.05),11%,4%含藥量組和市售三伏貼組在給藥前后大鼠撓鼻時間無顯著性差異(圖3)。3感冒動物模型的制備巴布劑中基質選擇十分重要,本研究以聚丙烯酸鈉作為基質,羧甲基纖維素鈉作為黏合劑,甘油和PEG400作為保濕劑,甘羥鋁作為交聯(lián)劑,通過單因素考察和正交設計優(yōu)選出初黏力和剝離強度適宜,人體感官評價較好的巴布劑處方。美中不足是當有效成分質量分數(shù)為17%時,存在膏體脫落現(xiàn)象,下步工作尚需解決該問題。哮喘發(fā)病機制復雜、病理生理機制不明確,許多臨床研究無法開展,因此復制接近人類哮喘病理生理狀態(tài)的哮喘動物模型意義重大。支氣管哮喘動物模型包括小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、犬、兔、羊、貓及靈長類等,常用動物為豚鼠。豚鼠易致敏,接受致敏物質后反應程度比較強,能產生I型變態(tài)反應。但豚鼠過敏反應差異較大,其變態(tài)反應多由IgG而非IgE介導,與人類不同。小鼠哮喘模型以其免疫、遺傳背景清楚得到廣泛應用。但也具有較多局限性:(1)不出現(xiàn)人類哮喘特征性的黏膜炎癥及上皮層嗜酸性細胞浸潤;(2)不出現(xiàn)人類哮喘典型的慢性氣道炎癥和上皮變化;(3)大多數(shù)模型出現(xiàn)過敏性肺泡炎和超敏性肺炎,掩蓋了氣道的炎癥損害;(4)氣道狹小,肺和支氣管功能測定技術難度大。大鼠品系純正、標本采集量大、對抗原反應較一致,能誘發(fā)