銀杏葉提取物對(duì)兔脊髓缺血再灌注后的保護(hù)作用

銀杏葉提取物對(duì)兔脊髓缺血再灌注后的保護(hù)作用

銀杏葉提取物是銀杏科植物的有效提取物。根據(jù)這項(xiàng)研究，它對(duì)心臟、大腦、肝臟和腎臟等器官的缺血性再灌注（i）有保護(hù)作用，但很少報(bào)告脊柱出血是否具有保護(hù)作用。本研究采用兔腹主動(dòng)脈阻斷建立脊髓IR損傷模型,探討銀杏葉提取物對(duì)脊髓IR損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1體質(zhì)量限高1級(jí)清潔級(jí)成年新西蘭大白兔27只,雌雄不限,體質(zhì)量2.4～3.1kg,平均2.7kg,由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第08-018。1.1.2博士德生物工程公司細(xì)胞凋亡試劑盒、Bcl-2和Bax蛋白免疫組化染色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程公司;超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)試盒,均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。1.1.3金納多gina鄉(xiāng)村注射液銀杏葉提取物為德國(guó)WillmarSchwabe制藥廠生產(chǎn)的金納多(Ginaton)注射液,批號(hào)668110,含24%黃酮苷、6%萜內(nèi)酯(包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、J及白果內(nèi)酯)及70%其他物質(zhì)(果酸、糖等)。1.2家兔左腎動(dòng)脈麻醉后再灌注參照Z(yǔ)ivin法,用戊巴比妥納按30mg/kg予以兔靜脈注射麻醉后,于兔左腎動(dòng)脈起始處下方0.5cm處夾閉腹主動(dòng)脈30min,然后去除血管夾進(jìn)行再灌注。1.3銀杏葉提取物內(nèi)壓強(qiáng)度27只大白兔,隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、模型組和銀杏葉提取物治療組,每組各9只。銀杏葉提取物治療組于腹主動(dòng)脈夾閉前30min及再灌注開(kāi)始后靜脈輸入銀杏葉提取物100mg/kg。模型組以等量生理鹽水替代銀杏葉提取物。假手術(shù)組僅暴露腹主動(dòng)脈,不夾閉血管,亦不予以藥物處理。1.4術(shù)后運(yùn)動(dòng)情況評(píng)分再灌注24、48h后分別采用單盲法對(duì)兔后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分:后肢完全癱瘓,0分;后肢嚴(yán)重的不全癱瘓,1分;后肢可以運(yùn)動(dòng)但不能跳躍,2分;后肢可以跳躍但明顯不穩(wěn),3分;后肢可以跳躍但有輕微不穩(wěn),4分;后肢運(yùn)動(dòng)功能完全正常,5分。1.5脊柱組織指標(biāo)的檢測(cè)1.5.1mda及sod含量測(cè)定再灌注48h后取缺血部位的脊髓組織,稱重后制成勻漿。采用硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid,TBA)法測(cè)定MDA含量;黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD含量。操作步驟均按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。組織蛋白采用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行定量。1.5.2抗生物素活性成分檢測(cè)再灌注48h后取L5部位脊髓前角灰質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxyribonucleotidyltransferase,TdT)介導(dǎo)的帶生物素dUTP缺口末端標(biāo)記(TdT-mediateddUTP-biotinnickendlabeling,TUNEL)法原位檢測(cè)再灌注脊髓組織的細(xì)胞凋亡情況;采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-biotinperoxidasemethod,SP)檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。操作步驟均按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn):TUNEL法為細(xì)胞核及核膜被染成棕褐色;SP法為胞漿被染成棕褐色。1.5.3細(xì)胞凋亡指數(shù)和bcl-2、bax蛋白表達(dá)水平的測(cè)定采用圖像分析儀(×900)觀察各組實(shí)驗(yàn)兔L5脊髓前角灰質(zhì)的細(xì)胞凋亡和免疫組化切片,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野,計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptoticindex,AI)和Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)水平。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料均數(shù)用xˉ±sxˉ±s表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較采用秩和檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1灌注后24h的術(shù)后情況假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)兔后肢運(yùn)動(dòng)功能正常。模型組和銀杏葉提取物治療組實(shí)驗(yàn)兔于缺血再灌注后均出現(xiàn)不同程度的癱瘓,再灌注后24～48h,部分兔的后肢運(yùn)動(dòng)功能再次惡化,甚至出現(xiàn)第2次癱瘓。銀杏葉提取物治療組實(shí)驗(yàn)兔后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況要優(yōu)于模型組,于IR后24、48h,兩組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。2.2模型組與假手術(shù)組sod、mda含量的比較假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)兔脊髓組織的SOD含量較高,而MDA則處于較低水平。模型組SOD含量則有明顯降低,MDA含量明顯升高,與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。銀杏葉提取物治療組與模型組比較,SOD含量明顯升高,MDA含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。2.3銀杏葉提取物對(duì)小鼠骨髓中bax-2蛋白表達(dá)的影響假手術(shù)組脊髓組織未見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,Bcl-2、Bax蛋白亦呈極少量表達(dá)。模型組脊髓組織可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞,Bax蛋白在缺血組織中大量表達(dá),而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)則較低,兩者比例失調(diào)。與模型組比較,銀杏葉提取物治療組凋亡細(xì)胞明顯減少,Bax蛋白的表達(dá)明顯降低,Bcl-2蛋白的表達(dá)則有增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3和圖1～7。3銀杏葉提取物對(duì)髓中細(xì)胞凋亡的調(diào)控IR損傷時(shí)最重要的毒性物質(zhì)是自由基,而脂質(zhì)過(guò)氧化是其主要的損傷機(jī)制。脊髓發(fā)生IR后,黃嘌呤、次黃嘌呤等ATP代謝產(chǎn)物及黃嘌呤氧化酶大量生成,并產(chǎn)生大量的氧自由基,作用于細(xì)胞膜磷脂,使溶酶體、線粒體和細(xì)胞膜遭受破壞。神經(jīng)組織中的脂質(zhì)含量較高,因此脊髓對(duì)自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)尤為敏感,自由基可通過(guò)多種途徑(膜損傷、線粒體損傷、DNA直接損傷等)導(dǎo)致脊髓神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡或壞死。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),脊髓IR損傷動(dòng)物的后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分與假手術(shù)組比較有明顯下降,其脊髓組織中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量升高而抗氧化酶SOD的含量則有明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,驗(yàn)證了氧自由基在脊髓IR中所起的損傷作用。以往認(rèn)為,脊髓缺血后神經(jīng)細(xì)胞的死亡方式為缺血壞死。但近年來(lái)有研究認(rèn)為,細(xì)胞凋亡可能是脊髓缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式。Hayashi等報(bào)道,脊髓發(fā)生IR損傷后,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡主要與凋亡程序的激活有關(guān)。細(xì)胞凋亡與多種機(jī)制相關(guān),如自由基作用和基因調(diào)控。氧自由基可以通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷細(xì)胞膜和線粒體膜等途徑誘導(dǎo)促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),啟動(dòng)凋亡程序。已有多項(xiàng)研究表明,氧自由基可以通過(guò)啟動(dòng)Bcl-2、Bax等細(xì)胞凋亡相關(guān)因素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。Bcl-2與Bax是重要的凋亡調(diào)控基因,前者抑制細(xì)胞凋亡,后者促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2與Bax表達(dá)的比值可以提示細(xì)胞是否發(fā)生凋亡,兩者比值增高時(shí)促進(jìn)細(xì)胞存活,否則細(xì)胞發(fā)生死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組脊髓組織中Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)基本呈陰性;模型組則可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞,Bax蛋白在缺血的脊髓組織中大量表達(dá),Bcl-2則表達(dá)較低,兩者比例失調(diào),這與自由基的變化相一致,提示自由基在脊髓IR損傷時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡起著重要的作用。銀杏葉提取物中含有黃酮苷、萜烯內(nèi)酯這兩類主要的活性成分,具有明顯的清除自由基的作用。其中黃酮類化合物(山奈酚、槲皮素、異鼠李素等)可顯著降低超氧陰離子自由基的濃度。Xin等報(bào)道,銀杏葉提取物可以通過(guò)清除自由基以保護(hù)小腦顆粒細(xì)胞免受過(guò)氧化損傷,并能對(duì)抗自由基誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Smith等報(bào)道,銀杏葉提取物能上調(diào)PC12細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)、抑制caspase-3的激活、下調(diào)caspase-12及減少細(xì)胞色素C的釋放,并能減少DNA斷裂的發(fā)生,從而減少細(xì)胞凋亡。Unal等發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期給予銀杏葉提取物可以增加大鼠局灶性腦缺血后Bcl-2基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),銀杏葉提取物能明顯降低IR后脊髓組織中MDA的含量,保護(hù)SOD的活性,提示銀杏葉提取物能夠減輕由氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)脊