經(jīng)穴注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合中藥對(duì)糖尿病大鼠下肢血流的影響

經(jīng)穴注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合中藥對(duì)糖尿病大鼠下肢血流的影響

下肢缺血性疾病主要由下肢動(dòng)脈阻塞、血栓閉塞性脈管炎和糖尿病引起。與股淺動(dòng)脈、腓動(dòng)脈、脛骨前動(dòng)脈和脛骨后動(dòng)脈一樣，也有鎮(zhèn)靜、疼痛、感染、四肢壞死等疾病，最后約1.3名患者需要四肢骨折。臨床常用血管搭橋術(shù)、球囊擴(kuò)張術(shù)、支架植入術(shù)、動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)等手術(shù)方法進(jìn)行治療,但術(shù)后早期容易并發(fā)血栓形成,后期血管再度狹窄。而保守治療效果不佳,給患者身心造成很大痛苦。近年來(lái)研究表明,目前主要是骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bonemarrowmononuclearcell,BMNC)和自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)移植,可定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)“血管生成”及“血管新生”,進(jìn)而改善缺血肢體血液循環(huán)。董建勛教授在傳統(tǒng)移植方法的基礎(chǔ)上不斷探索創(chuàng)新,率先在國(guó)內(nèi)開展了辨證循經(jīng)注射BMNC的方法,探索性治療慢性下肢缺血性疾病42例,取得了較為滿意的療效。但是,對(duì)于循經(jīng)穴位注射BMSCs、肌肉注射BMSCs,以及聯(lián)合與單用益氣活血中藥這幾種方法哪個(gè)更有效以及經(jīng)穴注射BMSCs治療作用機(jī)制仍不清楚。為了比較這幾種治療方法的效應(yīng)差異,本研究采用經(jīng)穴、肌肉注射BMSCs、聯(lián)合以及單用益氣活血中藥的干預(yù)方法,監(jiān)測(cè)了各種方法干預(yù)DM大鼠缺血后肢血流灌注量和皮膚溫度的變化并分析了其機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。材料表面1.藥物、藥品和儀器80只體質(zhì)量為200-220gSPF級(jí)雄性SD大鼠,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001,并隨機(jī)分為8組,每組10只。1×PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物有限公司),鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),100μL微量注射器(高鴿牌,中國(guó)),PeriScanPIM型激光多普勒血流成像儀(瑞典PERIMEDABCO.)。益氣活血方藥物組成:生黃芪120g,黨參120g,炙甘草48g,當(dāng)歸120g,雞血藤120g,川牛膝48g等。飲片由北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供,符合1995年版《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定,并由北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室煎制。以上復(fù)方以大火煎開,文火水煎2次過(guò)濾去渣,合并水煎液后在中藥液體包裝機(jī)中濃縮成含生藥1.5kg/L溶液作為灌胃濃度(相當(dāng)于患者臨床正常用藥劑量的18倍)。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩７椒?.造模前后股動(dòng)脈并傳統(tǒng)采血模型的制備80只雄性SD大鼠,經(jīng)普食水適應(yīng)喂養(yǎng)1周后編號(hào),信封隨機(jī)抽取70只按50mg/kg劑量空腹腹腔注射STZ以制備糖尿病模型。于造模后3、7、14、28d尾靜脈采血針取血檢測(cè)隨機(jī)血糖濃度,以血糖值>16.0mmol/L作為糖尿病模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)。造模前,大鼠經(jīng)常規(guī)備皮、消毒、鋪巾,經(jīng)左側(cè)腹股溝韌帶中點(diǎn)(摸到股動(dòng)脈搏動(dòng)后)做1個(gè)1-1.5cm的縱行皮膚切口暴露股動(dòng)脈。正常假手術(shù)組與DM大鼠假手術(shù)組:游離股動(dòng)脈,不行結(jié)扎切除動(dòng)脈術(shù),直接縫合切口。DM缺血模型:大鼠左側(cè)后肢缺血模型。游離股動(dòng)脈后,用1號(hào)線結(jié)扎近端、遠(yuǎn)端股動(dòng)脈和部分遠(yuǎn)端隱動(dòng)脈,切除動(dòng)脈和所有側(cè)支血管。術(shù)畢,5-0縫合線縫合皮膚,建立糖尿病大鼠左側(cè)后肢缺血模型。2.實(shí)驗(yàn)方法及儀器正常假手術(shù)組(正常血糖假手術(shù)組)、DM假手術(shù)組(糖尿病大鼠假手術(shù)組)、DM缺血組(糖尿病大鼠缺血組):予局部注射1×PBS+蒸餾水灌胃;中藥組:缺血局部注射1×PBS+益氣活血中藥灌胃;局部注射組:缺血局部注射BMSCs+蒸餾水灌胃;局部+中藥組:缺血局部注射BMSCs+益氣活血方灌胃;穴位注射組:穴位注射BMSCs+蒸餾水灌胃;穴位+中藥組:穴位注射BMSCs+益氣活血方灌胃;采用全骨髓貼壁法獲取并傳代培養(yǎng)的第3代BMSCs,經(jīng)流式細(xì)胞分析合格,用于本實(shí)驗(yàn)。局部注射取缺血組織與正常組織交界處等距離選取5個(gè)點(diǎn)為注射部位,穴位注射取穴如下:足太陰脾經(jīng)三陰交:后肢內(nèi)踝尖直上10mm處;足少陰腎經(jīng)照海:后肢內(nèi)踝下1cm;足少陽(yáng)膽經(jīng)環(huán)跳:后肢髖關(guān)節(jié)后上緣;足少陽(yáng)膽經(jīng)陽(yáng)陵泉:后三里上外側(cè)5mm處;足陽(yáng)明胃經(jīng)后三里:膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下約5mm處;每只大鼠共注射100μL濃度為1×107/mLBMSCs,每處注射20μL。中藥濃度與劑量:1.5kg/L濃度中藥與灌蒸餾水灌胃劑量根據(jù)大鼠體重以10mL/kg進(jìn)行換算,于術(shù)后第2天起連續(xù)灌胃7d。使用PeriScanPIM型激光多普勒血流成像儀,激光波長(zhǎng)為670nm。本儀器采用NR掃描模式,觀察掃描面積寬10cm×10cm,掃描高度12-14cm,應(yīng)用LDPI2.5圖像軟件,進(jìn)行后肢體表血流圖的記錄、分析、處理。實(shí)驗(yàn)室室溫保持在23-25℃之間。激光多普勒血流成像儀(LDPI)其輸出結(jié)果以相對(duì)流量單位PU(灌注量)值表示,采用PU指數(shù)(PUI)=術(shù)側(cè)PU/健側(cè)PU,來(lái)表示術(shù)側(cè)微循環(huán)的血流情況,PUI越大微循環(huán)缺血程度越低,側(cè)支循環(huán)建立越好。本研究于術(shù)后2、7、14、21d在北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心檢測(cè)激光多譜勒血流流速及血流散斑圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA),兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),用ue0af±s表示,交互作用分析采用方差分析,以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。造模情況分析70只糖尿病大鼠造模1個(gè)月后,大鼠血糖維持在16.0mmol/L以上者61只,DM模型成模率為87.14%,成模率高,成模穩(wěn)定。在行大鼠左后肢缺血模型制備術(shù)后,DM大鼠左后肢缺血模型存活率為88.52%,每組大鼠造模情況見表1。經(jīng)檢驗(yàn),各組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布,方差齊,可以進(jìn)行比較。2.1穴位注射對(duì)pui術(shù)后第7天pui的影響經(jīng)t檢驗(yàn),術(shù)后各組大鼠第7、14、21天PUI與第2天PUI組內(nèi)比較,結(jié)果如下:正常血糖假手術(shù)組第7天PUI較第2天略有降低(P<0.05),穴位注射組、穴位+中藥組PUI于術(shù)后第7天略有升高(P<0.05);DM缺血組、中藥組、局部+中藥組、穴位注射組、穴位+中藥組PUI術(shù)后第14、21天大幅升高(P<0.05),且穴位+中藥組PUI術(shù)后21d顯著升高(P<0.01)。見表2,圖1。2.2各組pui差值比較術(shù)后第7天與第2天PUI差值組間的比較:與正常假手術(shù)組、DM假手術(shù)組比較,局部注射組、穴位注射組、穴位+中藥組的差值增加明顯(P<0.05);與中藥組比較,穴位注射組、穴位+中藥組差值增加明顯(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。術(shù)后第14天與第2天PUI差值組間的比較:與正常假手術(shù)組比較,DM缺血組、中藥組、局部+中藥組、穴位注射組、穴位+中藥組差值增加明顯(P<0.05);與DM假手術(shù)組比較,穴位+中藥組差值明顯增加(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。術(shù)后第21天與第2天PUI差值組間比較:與正常假手術(shù)組、DM假手術(shù)組比較,局部+中藥組、穴位注射組、穴位+中藥組差值增加明顯(P<0.05),與DM假手術(shù)組比較,DM缺血組、中藥組差值增加明顯(P<0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。3.穴位注射的單獨(dú)效應(yīng)與雙方差分析見表4。當(dāng)不用中藥時(shí),局部注射的單獨(dú)效應(yīng)為2.7;當(dāng)用中藥時(shí),局部注射的單獨(dú)效應(yīng)為1.5。經(jīng)方差分析,兩種干預(yù)方法的交互效應(yīng)F=0.01,P>0.05,兩者不存在交互效應(yīng)。當(dāng)不用中藥時(shí),穴位注射的單獨(dú)效應(yīng)為-11.8;用中藥時(shí),穴位注射的單獨(dú)效應(yīng)為-9.2,經(jīng)方差分析,兩種干預(yù)方法的交互效應(yīng)F=0.008,P>0.05,兩者不存在交互效應(yīng)。辨證循經(jīng)注射bmscs聯(lián)合中藥的方法及療效評(píng)價(jià)下肢缺血性疾病主要包括血栓閉塞性脈管炎、肢體動(dòng)脈硬化閉塞癥、糖尿病周圍血管病變等,屬于中醫(yī)“脫疽”范疇,屬周圍血管疾病中難治性疾病。糖尿病經(jīng)常合并下肢動(dòng)脈血管病變又稱糖尿病周圍血管病變(peripheralvasculardisease,PVD)是引起下肢缺血,最終導(dǎo)致截肢的主要原因。其發(fā)病率與非糖尿病者相比要高出20倍,嚴(yán)重的PVD患者除面臨下肢截肢的危險(xiǎn),其死亡風(fēng)險(xiǎn)也增加了4-7倍。當(dāng)前治療DM下肢缺血性疾病的主要方法有:祛聚、溶栓、擴(kuò)張血管、中醫(yī)中藥等,然而,這些方法主要用于病變?cè)缙凇⑤p度的患者及無(wú)法行血管重建的患者,且多數(shù)效果不甚理想。臨床將BMSCs移植到缺血的肢體可在局部形成血管內(nèi)皮細(xì)胞,產(chǎn)生新生血管,但臨床患者存在缺血部位廣泛、BMSCs容積、濃度等原因?qū)MSCs的分化及療效產(chǎn)生不利影響。董建勛教授在原有3種骨髓干細(xì)胞移植的方法(局部肌肉注射、靜脈注射與動(dòng)脈注射)基礎(chǔ)之上不斷探索、創(chuàng)新,提出辨證循經(jīng)注射BMSCs聯(lián)合中藥以提高BMSCs存活率、分化能力,以及療效的觀點(diǎn)。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)了該觀點(diǎn),經(jīng)穴注射BMSCs聯(lián)合益氣活血中藥干預(yù)糖尿病后肢缺血大鼠21d后,PUI達(dá)(88.80±10.44)%,使用經(jīng)穴注射BMSCs聯(lián)合中藥的方法,大鼠缺血后肢血流灌注恢復(fù)速度快,與經(jīng)穴注射BMSCs、局部注射BMSCs、局部注射BMSCs聯(lián)合中藥、單用中藥的方法相比,能顯著改善缺血大鼠后肢的血流量灌注,即經(jīng)穴注射BMSCs聯(lián)合益氣活血中藥的方法要明顯好于其他干預(yù)方法,但是益氣活血方中藥與經(jīng)穴注射BMSCs沒(méi)有明顯交互作用,需要進(jìn)一步研究探討。中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為,氣與血的關(guān)系還可以概括為“氣為血之帥”“血為氣之母”?！堆C論·陰陽(yáng)水火血?dú)庹摗氛f(shuō):“守氣者,即是血”,氣能生血、行血、攝血。諸多研究證明,益氣或活血方對(duì)改善微循環(huán)有促進(jìn)作用,但目前研究多為單一活血方或益氣方,益氣活血方對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用研究較少。氣有溫煦的作用,血有濡養(yǎng)的功能,四肢百骸、五臟六腑皆賴氣血以濡養(yǎng),氣能行血,血能載氣,血流灌注得以改善。另外,辨證選取足太陰脾經(jīng)、足陽(yáng)明胃經(jīng)、足少陰腎經(jīng)、足少陽(yáng)膽經(jīng)進(jìn)行循經(jīng)注射BMSCs。通過(guò)對(duì)穴位的刺激,一取其可以調(diào)暢經(jīng)絡(luò)之氣血;二可以濡養(yǎng)三陰、三陽(yáng)之經(jīng)脈;三可以滋養(yǎng)神經(jīng)肌肉組織;四可以通過(guò)對(duì)軀體傷害性傳入的抑制效應(yīng)達(dá)到鎮(zhèn)痛作用。董建勛教授認(rèn)為BMNC來(lái)源于骨髓血,屬于人體“陰中之陽(yáng)”,具有生發(fā)、溫煦、推動(dòng)等作用。辨證循經(jīng)注射BMNC,可以更好地發(fā)揮促進(jìn)血管再生,提高BMSCs存活率,以濡養(yǎng)經(jīng)脈,從而起到使缺血肢體