加味四逆散對慢性心理應(yīng)激反應(yīng)大鼠下丘腦c-fos表達(dá)的影響

加味四逆散對慢性心理應(yīng)激反應(yīng)大鼠下丘腦c-fos表達(dá)的影響

應(yīng)激反應(yīng)的主要特征是以朱元璋-下旬-腎上腺（hpa）軸的激活為核心的生理和心理反應(yīng)。而作為激素作用的第二信使-環(huán)核苷酸系統(tǒng)(cAMP、cGMP)的變化實(shí)質(zhì)上是在分子生物學(xué)水平上反映了機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下的生理及病理狀況的改變。目前即刻早期基因(IEG)作為第三信使,其在應(yīng)激時的表達(dá)以及與HPA軸活動的關(guān)系也已成為研究心理應(yīng)激腦中介機(jī)制的一個重要窗口。因此,進(jìn)一步研究兩者在心理應(yīng)激狀態(tài)下的變化以及之間的關(guān)系,對于闡明慢性心理應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制具有重要的意義。同時,本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步觀察了加味四逆散(JWSNS)對慢性心理應(yīng)激反應(yīng)時環(huán)核苷酸系統(tǒng)和c-fos蛋白表達(dá)的影響。材料和方法一、大鼠的限制制動采用束縛制動的方法。將造模大鼠置于自制的制動筒內(nèi)(由大鼠固定儀改制而成),通過移動插片而逐步縮小大鼠的活動空間,調(diào)節(jié)到其不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的緊張程度,每日限制制動1次,每日開始時間及限制制動時間不同,第1天為4h,其后每次增加30～60min,連續(xù)14d。造模大鼠在制動期間禁食、禁水。造模結(jié)束后在動物清醒、安靜狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。二、大鼠正常飼養(yǎng)Wistar大鼠,SPF級,雌雄各半,體質(zhì)量(180～220)g,由第一軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供。大鼠正常飲食,在光-暗周期為12h,溫度為(20±2)℃的安靜環(huán)境下飼養(yǎng)7d。按體重隨機(jī)分為3組:正常組,不施加任何刺激,應(yīng)激刺激前1h灌服2ml生理鹽水;模型組,給予束縛制動刺激,給藥同正常組;JWSNS組,給予束縛制動刺激,應(yīng)激刺激前1h灌服JWSNS濃縮液2ml。三、石決明等組成JWSNS由柴胡、白芍、枳殼、枸杞子、山梔、干地黃、石決明等組成。藥材由本校第一附屬醫(yī)院藥房提供,經(jīng)藥劑科鑒定均為純正藥材,常規(guī)煎煮取汁后濃縮至含生藥1.69g/ml,高壓滅菌,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。四、測試指標(biāo)和方法1.蒸干劑制備大鼠在造模結(jié)束后斷頭分離下丘腦,取下丘腦50mg加入2ml冷的、pH=4.75的醋酸緩沖液(濃度50mM)中,立即冰浴勻漿,懸浮液加入2ml無水酒精,靜置5min,3500×g離心15min,收取上清液,再用75%的酒精2ml洗沉淀,混勻后,3500×g離心15min,合并上清液,60℃烘干箱內(nèi)烘干,其烘干物放入4℃恒溫箱內(nèi)保存。采用放射免疫法檢測。cAMP、cGMP藥盒由中國原子能科學(xué)院提供,操作嚴(yán)格按說明書要求執(zhí)行。2.免疫組化檢測fos陽性神經(jīng)元表達(dá)采用免疫組化方法。應(yīng)激后,大鼠戊巴比妥鈉深麻醉(55mg/kg),經(jīng)升主動脈快速灌注37℃生理鹽水(0.9%)250ml,灌注4℃4%多聚甲醛液(pH=7.4)200～250ml,持續(xù)0.5～2h,剝離大鼠腦,修塊。置于同樣濃度的多聚甲醛固定液24h以上,石蠟包埋,連續(xù)冠狀切片,片厚約5μm。上述石蠟切片常規(guī)脫蠟,用3%H2O2-甲醇溶液37℃孵育30min,0.1%胰酶(滴加)37℃孵育15min,2%BSA(小牛血清白蛋白)37℃孵育2h,滴加兔抗多克隆fos抗體(稀釋度1:200),37℃孵育2h或4℃過夜,滴加生物素標(biāo)記的單抗兔IgG,稀釋度1:100,37℃孵育30min,滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素,稀釋度為1:100,37℃孵育15min,DAB顯色,顯微鏡下控制顯色時間3～5min,自來水沖洗,終止顯色反應(yīng),最后脫水透明和封片。各步驟之間均用0.01mol/LPBS沖洗3×5min。并用正常兔血清、PBS作陰性對照。以上所有試劑均由博士德生物試劑公司提供。采用Olympus顯微鏡觀察各腦片fos陽性神經(jīng)元的標(biāo)記,光鏡下,Fos蛋白免疫反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀,位于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi),核仁不著色,低倍鏡下為棕色小圓點(diǎn)。以每個單位視野(200μm)內(nèi)fos陽性神經(jīng)元的數(shù)目來表示數(shù)量,具體判斷標(biāo)準(zhǔn)為21～30個為+++,11～20個為++,2～10個為+,2個以下為-。觀察計數(shù)后攝片。大鼠腦區(qū)及核團(tuán)定位參考《大鼠腦立體定位圖譜》。觀察部位:海馬、大腦皮質(zhì)、杏仁核、下丘腦室旁核(Pa)、室周核(Pe)以及弓狀核(Arc)。五、統(tǒng)計方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。結(jié)果一、著升著升著模型組大鼠下丘腦cAMP、cGMP均顯著升高(P<0.01)。JWSNS可明顯降低應(yīng)激大鼠下丘腦cAMP、cGMP含量(P<0.05),見表1。二、大鼠腦出血后pa、pe的表達(dá)連續(xù)14d的束縛制動可以誘導(dǎo)c-fos在大鼠海馬、大腦皮質(zhì)、杏仁核、下丘腦Pa、Pe以及Arc內(nèi)廣泛持續(xù)表達(dá),其中以大腦皮質(zhì)、杏仁核最為密集。正常組大鼠在下丘腦Pa、Pe偶見零星的c-fos表達(dá),但染色較弱。JWSNS可明顯降低上述腦區(qū)核團(tuán)c-fos陽性神經(jīng)元的數(shù)目,減少c-fos蛋白的表達(dá),見表2和圖1。jwsns對慢性心理應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控作用在應(yīng)激反應(yīng)中,作為激素作用的第二信使,cAMP、cGMP的變化實(shí)質(zhì)上是在分子生物學(xué)水平上反映了機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下的生理及病理狀況的改變。本實(shí)驗(yàn)觀察到,慢性心理應(yīng)激反應(yīng)可使大鼠下丘腦cAMP、cGMP含量均顯著增加,這與我們以往和此次實(shí)驗(yàn)中所觀察到的ACTH、CRH、DA、NE、AVP含量升高的結(jié)果是一致的。也有一些報道認(rèn)為,反復(fù)應(yīng)激或非急性應(yīng)激,機(jī)體血漿或腦皮質(zhì)cAMP水平下降。這提示急性和非急性,反復(fù)和不同情況的反復(fù)(如本實(shí)驗(yàn)所采用的方法)的應(yīng)激可能存在著不同的作用機(jī)制。催化cGMP合成的鳥苷酸環(huán)化酶家族主要分為顆粒樣酶和可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(GCA),后者主要被NO所激活。NO作為信息分子,介導(dǎo)著興奮性遞質(zhì)谷氨酸(Glu)到cGMP的反應(yīng)鏈。我們以往的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),慢性心理應(yīng)激反應(yīng)可使腦內(nèi)Glu含量增加,這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的下丘腦cGMP含量顯著升高是一致的,這也提示慢性心理應(yīng)激存在著神經(jīng)元的損害。升高的cGMP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可通過激活或抑制磷酸二脂酶,改變cAMP的含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中cAMP含量的升高也可能與心理應(yīng)激狀態(tài)下cGMP激活磷酸二脂酶有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到,中藥復(fù)方JWSNS可明顯降低下丘腦cAMP、cGMP含量,說明,JWSNS可通過影響環(huán)核苷酸系統(tǒng)而參與對慢性心理應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控。即刻早期基因(immediateearlygenes,IEG)的表達(dá)可以在細(xì)胞水平反映神經(jīng)元的活動。目前有關(guān)慢性應(yīng)激時c-fos表達(dá)變化的研究報道很少。本實(shí)驗(yàn)建立的慢性心理應(yīng)激反應(yīng)模型,采用的是連續(xù)14d的束縛制動刺激(造模時間不固定,每次制動時間不同),在這種方法所造成的慢性心理應(yīng)激反應(yīng)中,IEG表達(dá)是如何變化的,目前國內(nèi)外未有報道。反復(fù)同一形式的刺激可產(chǎn)生中樞c-fos表達(dá)的“耐受性”或“習(xí)慣化”,并且不同形式的刺激引起中樞c-fos的表達(dá),相互之間不存在“交叉耐受”。本實(shí)驗(yàn)采用的慢性心理應(yīng)激刺激過程中,使大鼠對灌胃、抓捉等應(yīng)激刺激產(chǎn)生適應(yīng)性,排除了這些應(yīng)激刺激對c-fos的誘導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果與其他一些研究的報道存在著一定的差別,主要表現(xiàn)在:(1)一些研究結(jié)果表明,慢性重復(fù)應(yīng)激后,c-fos表達(dá)逐漸減弱,即所謂“習(xí)慣化”,與急性應(yīng)激相比,所表達(dá)的腦區(qū)部位都大量減少(包括室旁核和杏仁核等)。而本實(shí)驗(yàn)觀察卻發(fā)現(xiàn),連續(xù)14d的限制制動刺激仍然可以誘導(dǎo)c-fos在大鼠海馬、大腦皮質(zhì)、杏仁核、Pa、Pe以及Arc內(nèi)廣泛持續(xù)表達(dá),其中以大腦皮質(zhì)、杏仁核最為密集。(2)一些研究報道,急性心理應(yīng)激或情緒應(yīng)激,或其他一些急性應(yīng)激(包括強(qiáng)迫游泳、電擊、寒冷、次聲等)所誘導(dǎo)的c-fos表達(dá)的部位涉及到大腦皮質(zhì)、杏仁核、Pa、Pe、Arc、杏仁內(nèi)側(cè)核(Me)、下丘腦背內(nèi)側(cè)核彌散部(DMD)、前連合核(AC)、孤束核(Sol)、丘腦外側(cè)背核(LD)、額皮質(zhì)(Fr)、扣帶皮質(zhì)(Cg)等。而本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果卻提示:慢性心理應(yīng)激原所激活的腦區(qū)也涉及到海馬、大腦皮質(zhì)、杏仁核、Pa、Pe等。出現(xiàn)上述差別的可能原因:(1)慢性重復(fù)應(yīng)激后,c-fos表達(dá)逐漸減弱,出現(xiàn)“習(xí)慣化”,這符合c-fos自身的特異性。作為非特異性轉(zhuǎn)錄因子的c-fos表達(dá)習(xí)慣化的特點(diǎn)即是此方式的一種具體體現(xiàn)。而本實(shí)驗(yàn)所采用的方法雖然在刺激形式上單一,但由于刺激時間不固定,每次刺激的持續(xù)時間不同,因而在一定程度上避免了大鼠對束縛制動的習(xí)慣化,這可能是c-fos表達(dá)持續(xù)存在的原因之一。(2)在上述論述的基礎(chǔ)上,可以認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)的大鼠仍然處于心理應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)的狀態(tài),因此,c-fos表達(dá)的腦區(qū)范圍可能仍然較為廣泛。本實(shí)驗(yàn)觀察到,中藥復(fù)方JWSNS可以不同程度地降低c-fos在上述核團(tuán)中的表達(dá),說明:(1)海馬、大腦皮質(zhì)