生物反應(yīng)工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

生物反應(yīng)工程大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)生物工程專業(yè)用生物工程教研室編著2014年9月淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究前言：酶是一種生物催化劑，它具有催化劑屬性，同是也具有一些無(wú)機(jī)催化劑所不具有的特性。酶是具有催化特定化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)、RNA或其復(fù)合體，是生物催化劑，能通過降低反應(yīng)的活化能加快反應(yīng)速度，但不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要研究淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)。淀粉是植物體中貯存的養(yǎng)分，貯存在種子和塊莖中，各類植物中的淀粉含量都較高。淀粉是葡萄糖的高聚體，在餐飲業(yè)又稱芡粉，通式是(C6H10O5)n，水解到二糖階段為麥芽糖，化學(xué)式是（C12H22O11），完全水解后得到葡萄糖，化學(xué)式是（C6H12O6）。淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉兩類。淀粉酶廣泛分布于動(dòng)物（唾液、胰臟等）、植物（麥芽、山萮菜）及微生物。淀粉酶一般可作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷鍵的酶。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急劇下降和，最終產(chǎn)物在分解直鏈淀粉時(shí)以葡萄糖為主，此外，還有少量麥芽三糖及麥芽糖，其中真菌α-淀粉酶水解淀粉的終產(chǎn)物主要以麥芽糖為主且不含大分子極限糊精，在烘焙業(yè)和麥芽糖制造業(yè)具有廣泛的應(yīng)用。另一方面在分解支鏈淀粉時(shí)，除麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖外，還生成分支部分具有α-1，6-鍵的α-極限糊精（又稱α-糊精）。一般分解限度以葡萄糖為準(zhǔn)是35-50%，但在細(xì)菌的淀粉酶中，亦有呈現(xiàn)高達(dá)70%分解限度的（最終游離出葡萄糖）。本實(shí)驗(yàn)通過利用淀粉酶水解可溶性淀粉產(chǎn)生還原糖，還原糖可使3，5-二硝基水楊酸還原，生成棕色的3-氨基-5硝基水楊酸。淀粉酶活力與還原糖的量成正比，用比色法測(cè)定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位質(zhì)量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成還原糖的量表示酶活力。通過此原理進(jìn)行淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。通過研究淀粉酶的性質(zhì)，可使我們更好的了解它，并充分利用于工業(yè)生產(chǎn)、食品加工、醫(yī)療等產(chǎn)業(yè)。實(shí)驗(yàn)一pH對(duì)酶活性的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈖H對(duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)。二、實(shí)驗(yàn)原理pH對(duì)酶活性影響的機(jī)理：pH影響酶活性中心某些必須基團(tuán)的解離,而這些基團(tuán)往往僅在某一解離狀態(tài)時(shí)才最容易同底物結(jié)合或具有最大催化活性；pH影響可解離基團(tuán)的底物和輔酶的荷電狀態(tài),從而影響酶對(duì)他們的親和力；pH還可以影響酶活性中心的空間構(gòu)象,從而影響酶的活性。本實(shí)驗(yàn)以淀粉酶為材料來(lái)研究pH對(duì)酶活性的影響。三、主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1.實(shí)驗(yàn)材料α-淀粉酶2.實(shí)驗(yàn)儀器（1）721可見分光光度計(jì)；（2）磁力攪拌器；（3）恒溫水浴鍋；（4）燒杯：100mL、500mL；（5）標(biāo)準(zhǔn)試管；（6）三角瓶：100mL、250mL；（7）漏斗；（8）容量瓶；（9）電子天平（千分之一）；（10）移液管等。3.試劑（1）0.2M磷酸氫二鈉溶液：稱取35.61g含2個(gè)結(jié)晶水的磷酸氫二鈉，用水定容至1L。（2）0.1M檸檬酸溶液：稱取21.01g含一個(gè)結(jié)晶水的檸檬酸，用水定容至1L。（3）3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：DNS試劑配制：50g3,5二硝基水楊酸溶于4000mL水中，不斷攪拌，緩緩加入80g氫氧化鈉，使之完全溶解，繼續(xù)攪拌，將1500g酒石酸鉀鈉分?jǐn)?shù)次少量加入，并小心加熱，溶液最高溫度不超高45℃。冷卻至室溫后定容至5000mL，置棕色（4）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100ml，即含葡萄糖為2.0mg/ml。（5）2%淀粉溶液：稱取2g可溶淀粉，放入小燒杯中，加少量蒸餾水做成懸浮液。然后在攪拌下注入沸騰的蒸餾水中，繼續(xù)煮沸一分鐘，冷卻后加蒸餾水定容至100ml。4．淀粉酶活力測(cè)定淀粉酶活性測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法：取酶液用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液適度稀釋，取0.lmL加入0.9ml預(yù)先在50℃水浴中準(zhǔn)確保溫10min的底物溶液(2mg/mL可溶性淀粉，pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制)中（每個(gè)樣品同時(shí)做3支平行），50℃準(zhǔn)確反應(yīng)10min，加入2mlDNS沸水浴5min，用冷水快速冷卻，在721分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540nm下測(cè)定OD值。同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照測(cè)定，取稀釋酶液0.lmL，先加入DNS試劑2.0mL，再加入淀粉底物溶液0.9ml，其余步驟與樣品測(cè)定相同。具體加樣順序見下表：對(duì)照樣平行樣酶液100μL100μLDNS2mL底物900μL900μL反應(yīng)50℃10min50℃10minDNS2mL顯色100℃5min100℃5min吸光值測(cè)定OD540OD540酶單位定義為:在50℃，pH6.0條件下每分鐘從底物中釋放1μmol還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。四、實(shí)驗(yàn)操作1．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（可使用實(shí)驗(yàn)一中的數(shù)據(jù)）取15mm×180mm試管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水，每個(gè)做3個(gè)平行。管號(hào)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水葡萄糖含量OD540/ml/ml/mg0100.210.800.4

2

0.40.60.8

3

0.60.41.2

40.80.21.6

5102操作方法：在上述試管中分別加入DNS試劑2.0ml，于沸水浴中加熱5min進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，各加入蒸餾水9.0ml，搖勻，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值。以1.0ml蒸餾水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液按同樣顯色操作為空白調(diào)零點(diǎn)。以光吸收值為橫坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出直線回歸方程（y=ax+b）。2．不同pH緩沖溶液的配制取六只潔凈的三角瓶，按表1編號(hào)和加試劑：表1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的配制三角燒瓶號(hào)123456pH值3.04.05.06.07.08.00.2M磷酸二氫鈉（ml）4.117.7110.3012.6316.4719.450.1M檸檬酸（ml）15.8912.299.707.373.530.553．不同pH底物溶液的的配制用2中的緩沖液分別配置相應(yīng)pH的底物。4．pH對(duì)酶活性影響的測(cè)定用2中不同pH的緩沖液將酶液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)（即在pH7.0條件下反應(yīng)，540nm光吸收在1.2左右的稀釋倍數(shù)）,并與3中相同pH的底物在37°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)過程參照淀粉酶活力測(cè)定部分。五、結(jié)果處理記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算，以pH為橫坐標(biāo)、酶促反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)作圖，繪制pH(3.0-8.0)條件下的pH-酶促反應(yīng)速度反應(yīng)曲線，進(jìn)行合理分析。六、討論1.pH與酶促反應(yīng)速度曲線是什么形狀的，為什么？2酶的最適pH值受哪些因素影響？注意事項(xiàng)：1．加入淀粉酶的量要準(zhǔn)確2．保溫時(shí)間要準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)二溫度對(duì)酶活性的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鉁囟葘?duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)。二、實(shí)驗(yàn)原理每種酶都有其最適溫度，高于或低于此溫度酶的活性都降低。一般而言，若酶處于過高的溫度環(huán)境中，會(huì)使酶活性永久喪失；而若處于極低溫度的環(huán)境中只會(huì)使酶活性受到抑制，一旦溫度適宜，酶又會(huì)全部或部分的恢復(fù)其活性。三、主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1.實(shí)驗(yàn)材料α-淀粉酶2.實(shí)驗(yàn)儀器同實(shí)驗(yàn)一。3.試劑pH7.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：量取16.47ml的0.2M磷酸氫二鈉和3.53ml的0.1M檸檬酸混合搖勻即可。其他同實(shí)驗(yàn)一。4．淀粉酶活力測(cè)定同實(shí)驗(yàn)一。四、實(shí)驗(yàn)操作在最適pH條件下，使酶在不同溫度(50°C-80°C)條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，通過測(cè)定酶活性來(lái)確定最適反應(yīng)溫度。即用pH7.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋酶液到適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)（即在pH7.0條件下反應(yīng)，540nm光吸收在1.2左右的稀釋倍數(shù)），再加入pH7.0的淀粉底物，然后分別在50°C、60°C、70°C、80°C、90°C進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)步驟參見實(shí)驗(yàn)一。五、結(jié)果處理記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算，以溫度為橫坐標(biāo)、酶促反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)，對(duì)溫度與酶促反應(yīng)速度作圖，進(jìn)行合理分析。六、討論1.溫度與酶促反應(yīng)速度曲線是什么形狀的，為什么？2．酶的最適溫度受哪些因素影響？實(shí)驗(yàn)三底物濃度對(duì)酶活性的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饷笣舛葘?duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)。二、實(shí)驗(yàn)原理在適宜的條件下，若酶濃度一定時(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度增加而增加，兩者間成正比。但若反應(yīng)底物濃度達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到最大值，此后隨底物濃度的增加，反應(yīng)速率基本不變。本實(shí)驗(yàn)以淀粉酶為例。加入不同濃度的底物，并比較在同一適當(dāng)時(shí)間后，以DNS法檢驗(yàn)還原糖的含量從而確認(rèn)其反應(yīng)程度。三、主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑同實(shí)驗(yàn)一。四、實(shí)驗(yàn)操作1．不同濃度底物的配制用pH7.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2%的淀粉底物。2．酶促反應(yīng)將酶液用pH7.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)（即在pH7.0條件下反應(yīng)，540nm光吸收在1.2左右的稀釋倍數(shù)），將保溫后的1中不同濃度的底物，快速加入到上述試管中，搖勻，立即放入50°C恒溫水浴中，進(jìn)行酶促反應(yīng)。具體步驟見淀粉酶活力測(cè)定。五、結(jié)果處理記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算，以底物濃度為橫坐標(biāo)、反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)，對(duì)底物濃度與反應(yīng)速度作圖，進(jìn)行合理分析。六、討論底物濃度與反應(yīng)速度的曲線是否符合米氏動(dòng)力學(xué)曲線，為什么？實(shí)驗(yàn)四淀粉酶Km和Vmax值的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響2．掌握米氏方程、Km、Vmax值的物理意義及雙倒數(shù)作圖求Km、Vm值的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1．米氏方程：Michaelis-Menten在研究底物濃度與酶促反應(yīng)速度的定量關(guān)系時(shí)，導(dǎo)出了酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的基本公式，即：QUOTE(1)式中：V表示酶促反應(yīng)速度，Vmax表示酶促反應(yīng)最大速度，[S]表示底物濃度，Km表示米氏常數(shù)。2．Km值的測(cè)定主要采用圖解法，主要有四種：雙曲線作圖法、Lineweaver-Burk作圖法雙倒數(shù)作圖法、Hofstee作圖法和Hanas作圖法。由于Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法簡(jiǎn)單方便得到了廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)主要以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法來(lái)測(cè)定淀粉酶的Km值。其作圖原理如下（圖1）：取（1）式的倒數(shù)，變換為L(zhǎng)ineweaver-Burk方程式：QUOTE(2)以1/V對(duì)1/[S]作圖，即為y=ax+b形式。此時(shí)斜率為Km/Vmax，縱截距為1/