姜黃素對脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞分化的影響

姜黃素對脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞分化的影響

脊柱損傷（pci）是一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷?？赡苁亲畛Ｒ姷脑蚴墙煌ㄊ鹿屎投嗵帀嬄?。沒有有效的治療措施。目前,SCI后的細胞替代治療已成為研究的熱點領域,包括外源性干細胞移植和激活并誘導內(nèi)源性干細胞(endogenousneuralstemcells,ENSCs)。與外源性神經(jīng)干細胞移植相比,激活和誘導內(nèi)源性神經(jīng)干細胞不存在安全及倫理問題,無排異反應。Johansson等首次發(fā)現(xiàn)并證實成年大鼠的室管膜細胞就是神經(jīng)干細胞,另有研究證實在脊髓室管膜區(qū)和脊髓實質均能培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞。對SCI的研究顯示可以通過藥物、手術及康復等干預手段使內(nèi)源性神經(jīng)干細胞可塑性發(fā)揮出巨大的潛力,從而改善SCI后神經(jīng)功能的修復。姜黃素(curcumin)作為傳統(tǒng)中藥材,廣泛應用于風濕病、發(fā)熱、腸道疾病、外傷、閉經(jīng)等多種病癥而無明顯副作用。近年來對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究顯示姜黃素具有明顯的神經(jīng)保護作用。本實驗通過應用姜黃素干預大鼠脊髓挫傷模型,觀察脊髓損傷后大鼠后肢功能恢復情況及其對脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的誘導及分化,并嘗試研究姜黃素產(chǎn)生上述作用的機制。1材料和方法1.1抗大鼠硫酸軟骨素蛋白多糖的藥物兔抗大鼠巢蛋白(Nestin)一抗、小鼠抗大鼠Tuj1一抗、兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)一抗、小鼠抗大鼠硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitinsulfateproteoglycans,CSPG)一抗、兔抗大鼠Wnt3a一抗購自美國Abcam公司;姜黃素、兔抗大鼠β-catenin一抗購自美國Sigma公司;山羊抗兔IgG-FITC二抗購自中杉金橋公司,山羊抗小鼠IgG-Cy3二抗購自碧云天公司。1.2分組及分組72只成年雄性SD大鼠,由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供,體質量(250±20)g,按隨機數(shù)字表法分為3組:假手術組(A組,n=12)、單純損傷組(B組,n=30)、姜黃素處理組(C組、n=30)。B、C組于造模后分別設1d,1、2、4、8周共5個觀察時相點,每個時相點6只。1.3造模手術成功分析采用與人類脊髓損傷病理過程高度相似的脊髓夾傷模型。5%水合氯醛按7mL/kg腹腔注射麻醉大鼠,以T10棘突為中心作一長約4cm縱行切口,鈍性分離附著于棘突兩側的肌肉,暴露T8~T10棘突及椎板,蚊式鉗自相鄰椎板間隙起向兩側咬除T9、T10椎板骨質,充分顯露T9~T10節(jié)段脊髓,保留硬膜。假手術組僅行椎板切除術,單純損傷組、姜黃素處理組以標定力量為70g力的動脈瘤夾壓迫T9~T10脊髓1min,壓迫數(shù)秒后大鼠出現(xiàn)擺尾反射、雙下肢痙攣性抽搐提示造模成功。仔細止血并用慶大霉素沖洗術野,絲線縫合肌肉、皮膚,模型制備完成。1.4術后處理及術后時間大鼠適應性飼養(yǎng)3d后造模并給藥,姜黃素以二甲基亞砜(DMSO)助溶。姜黃素處理組大鼠造模成功后于術后30min按200mg/kg給予首次腹腔注射姜黃素,共注射7d。單純損傷組按相同方法給予等量生理鹽水。單純損傷組、姜黃素處理組大鼠造模后每日按壓膀胱排尿2次,間隔12h,2~3周后大鼠排便功能基本恢復。實驗過程中對實驗動物的處置符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。1.5大鼠腰椎組織病理學檢測造模后在各時相點麻醉大鼠后開胸,經(jīng)左心室插管快速灌注約100mL生理鹽水,直至右心耳溢出清亮液體,再以含濃度為4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)250mL灌注至大鼠四肢及軀干僵硬。將大鼠脊柱完整從軀干上分離,小心解剖椎管將脊髓完整取出,以脊髓損傷部位為中心取2cm脊髓組織,置入4%多聚甲醛溶液于4℃冰箱固定24h,再入30%蔗糖溶液中脫水至組織標本沉底后取出,常規(guī)石蠟包埋,石蠟切片機(Leica)作厚為5μm的縱行連續(xù)切片備用。同法在低溫環(huán)境下取脊髓新鮮組織標本,于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.6術后功能恢復情況大鼠脊髓損傷后分別于相應時相點采用BBB(basso,beattiandbresnahan)法和Rivlin法斜板實驗評估大鼠后肢功能恢復情況。BBB評分:將動物置于測試平臺后持續(xù)觀察4min,記錄其后肢的活動。0分表示后肢完全癱瘓無活動能力,21分表示運動能力正常。斜板實驗:將表面粗糙的橡膠墊固定于斜板上,逐漸增加斜板與水平面之間的角度,直至大鼠剛好可在板上停留5s,記錄這一角度值,每只大鼠測3次,取平均值。1.7微波抗體檢測石蠟切片常規(guī)脫蠟復水后用含0.5%TritonX-100的PBS浸洗,檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中行微波抗原修復,10%正常山羊血清封閉,滴加兔抗大鼠Nestin一抗(1∶1000)于4℃孵育過夜;滴加山羊抗兔IgG-FITC二抗(1∶200)室溫孵育1h,DAPI復染細胞核,抗熒光淬滅封片劑封片,激光共聚焦顯微鏡(zeissSLM780)觀察結果。同法行Tuj1單標及GFAP/CSPG雙標免疫熒光染色。1.8聚二氟乙烯膜的制備各組標本提取脊髓損傷節(jié)段50mg組織總蛋白測定其含量,行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS),轉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,封閉后加一抗4℃孵育過夜(wnt3a1∶2000,β-catenin1∶4000);TBST洗膜,加入二抗孵育2h,再與化學發(fā)光底物結合。結果用圖像處理掃描儀掃描Westernblot膠片,應用QuantityOne軟件分析各組條帶的平均光密度值。1.9統(tǒng)計分析應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)以x珋±s表示,組間比較行獨立樣本t檢驗,多組間比較行單因素方差分析。2結果2.1大鼠后肢功能行為2.2免疫熒光成像2.3單純損傷組wnt3a、-catenin表達量假手術組大鼠脊髓組織在各時間點的Wnt3a、β-catenin表達量均很低且無明顯差異(P>0.05);單純損傷組在1d時Wnt3a、β-catenin表達量即明顯升高,1周時達到高峰,4周后明顯減弱,8周時恢復正常水平;姜黃素處理組中Wnt3a、β-catenin的表達量與單純損傷組趨勢相似,但各時間點的表達量均顯著高于單純損傷組(P<0.05,圖4)。3干預髓損傷后活性成分的表達本研究通過應用姜黃素干預大鼠脊髓損傷發(fā)現(xiàn)損傷后在損傷區(qū)域附近的脊髓實質中出現(xiàn)了Nestin陽性的神經(jīng)干細胞,證實了成年哺乳動物處于靜息態(tài)的ENSCs在脊髓損傷后被激活。Tuj1是神經(jīng)元前體細胞標記物,表達于神經(jīng)元的胞體及突起,而神經(jīng)元前體細胞是由神經(jīng)干/祖細胞分化而來。本研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后在緊鄰損傷中心區(qū)域的灰質中幾乎看不到神經(jīng)元前體細胞,而給予姜黃素治療發(fā)現(xiàn)Tuj1陽性神經(jīng)元前體細胞數(shù)量明顯增多,說明姜黃素可誘導ENSCs向神經(jīng)元方向分化。本研究還發(fā)現(xiàn)通過應用姜黃素干預脊髓損傷可明顯抑制損傷后星形膠質細胞的活化,減輕膠質瘢痕的形成,同時抑制星形膠質細胞外基質分子的產(chǎn)生,有利于新生神經(jīng)組織的軸突再生。NSCs的發(fā)現(xiàn)打破了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后無法再生的傳統(tǒng)觀念,在成年哺乳動物脊髓中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞使得誘導ENSCs治療脊髓損傷成為可能。在正常情況下,這些內(nèi)源性神經(jīng)干細胞大多數(shù)處于靜止狀態(tài),而在脊髓損傷后這些內(nèi)源性神經(jīng)干細胞被大量激活,其增殖分化水平顯著提高。進一步研究發(fā)現(xiàn),脊髓損傷后被激活的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞大多數(shù)分化為星形膠質細胞參與了膠質瘢痕的形成,而很少分化為神經(jīng)元。膠質瘢痕不僅在空間上抑制神經(jīng)再生,構成膠質瘢痕的細胞內(nèi)基質和細胞外成分對神經(jīng)再生也有明顯抑制作用。本實驗室前期的研究也證實膠質瘢痕阻礙了神經(jīng)軸突的再生。因此,我們想到在脊髓損傷后給予適當?shù)母深A,減輕膠質瘢痕的形成,并使損傷后被激活的ENSCs更多地分化為神經(jīng)元而減少向星形膠質細胞分化的比例,從而改善SCI后神經(jīng)功能的康復。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有上述良好的生物學效應,可明顯改善大鼠脊髓損傷后后肢功能的恢復。臨床中常見的脊髓損傷病例是由機械外力作用導致脊椎骨折、脫位等造成的脊髓挫傷及擠壓傷,脊髓的完整性及連續(xù)性沒有遭到破壞,并且大多數(shù)病例是脊髓腹側與背側同時受壓,因此,本實驗所采用的脊髓夾傷模型是與臨床實際最為接近的損傷模型。本實驗研究了姜黃素與Wnt/β-catenin信號通路之間的關系。Wnt/β-catenin信號通路首先被發(fā)現(xiàn)在胚胎神經(jīng)干細胞發(fā)育中起關鍵調(diào)控作用,在成體動物的研究中發(fā)現(xiàn),Wnt3的過表達能顯著促進成年海馬的神經(jīng)發(fā)生,提高神經(jīng)元分化的比例;施加GSK3β抑制劑使β-catenin在細胞內(nèi)聚集能促進成年鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)前體細胞的增殖并向神經(jīng)元分化。在成年大鼠的脊髓損傷模型中給予外源性Wnt3a能使內(nèi)源性神經(jīng)干細胞更多的分化為神經(jīng)元。本實驗發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后Wnt3a及β-catenin的表達明顯上調(diào),并且其表達量的趨勢與ENSCs的增殖一致,故認為Wnt/β-catenin信號通路參與了損傷后ENSCs的增殖過程,而應用姜黃素干預脊髓損傷發(fā)現(xiàn)Wnt3a及β-catenin的表達量進一步上調(diào),同時ENSCs向神經(jīng)元分化。因此,我們推測姜黃素正是通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進脊髓損傷后被激活的ENSCs更多地向神經(jīng)元方向分化,從而改善大鼠脊髓損傷的預后。在多個研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過抑制核轉錄因子κB(nuclearfactorkapaaB,NF-κB)的活性而產(chǎn)生較強抗炎作用,從而起到神經(jīng)保護作用。對腦缺血模型的研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過改善線粒體功能的紊亂、降低細胞色素C的水平、抑制caspase-3的活化、抑制氧化應激反應等途徑阻止神經(jīng)細胞的凋亡。本課題組在前期的研究中也發(fā)現(xiàn),姜黃素可抑制脊髓損傷后急性期的炎癥反應,減少神經(jīng)細胞的凋亡,縮小損傷后期空洞的范圍,起到神經(jīng)保護的作用。Cemil等的研究也顯示姜黃素在脊髓損傷后早期即可通過抑制氧化應激反應從而保護神經(jīng)功。綜上所述,我們認為姜黃素對脊髓損傷后神經(jīng)功能修復的作用是通過其多種生物學效應而實現(xiàn)的。2.1.1理組大鼠髓損傷后1d行bcb評分比較假手術組大鼠行椎板切除術后后肢運動能力無異常,評分均為21分。單純損傷組、姜黃素處理組大鼠脊髓損傷后1d行BBB評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);自1周開始各時相點單純損傷組、姜黃素處理組大鼠后肢功能均逐漸有所恢復,單純損傷組于4周后達平臺期,姜黃素處理組大鼠在各時相點后肢功能恢復情況均優(yōu)于單純損傷組(P<0.05,表1)。2.1.2單次損傷大鼠骨髓損傷后1d行斜板實驗假手術組大鼠行斜板實驗可達75°左右,與正常大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單純損傷組、姜黃素處理組大鼠脊髓損傷后1d行斜板實驗差異無顯著性(P>0.05);自1周開始各時相點單純損傷組、姜黃素處理組大鼠行斜板實驗的臨界角度均逐漸升高,姜黃素處理組大鼠各時相點所測的角度值均大于單純損傷組(P<0.05,表2)。2.2.1in陽性細胞單純損傷組、姜黃素處理組脊髓損傷后1周可見到Nestin陽性細胞,其數(shù)量在2周時到達高峰,分散于損傷區(qū)域附近的脊髓實質中,胞體為卵圓形或多角形,至4周時未再見有Nestin陽性細胞,2組間無明顯差異(圖1)。2.2.2tuj1表達單純損傷組于脊髓損傷后1周在緊鄰損傷中心5mm范圍內(nèi)的灰質中偶可見到Tuj1陽性細胞及少量呈絲狀表達的Tuj1陽性神經(jīng)元突起,2周時在個別脊髓組織中可見少數(shù)Tuj1陽性神經(jīng)元細胞,且形態(tài)不典型,4周時Tuj1表達明顯減弱;姜黃素處理組于脊髓損傷后1周在緊鄰損傷區(qū)域的灰質中可見多個Tuj1陽性細胞密集排列,于傷后2周達到高峰,呈現(xiàn)出典型的神經(jīng)元形態(tài),細胞核大而圓并可見核仁,部分神經(jīng)元細胞可見到沿脊髓長軸方向伸出的樹突或軸突,4周時表達逐漸減弱(圖2)。2.