大黃甘草湯單煎與合煎過程中類化合物和甘草酸的含量變化

大黃甘草湯單煎與合煎過程中類化合物和甘草酸的含量變化

大黃甘草湯是“缺錢”的一部分。主要用于便秘，主要由大黃和甘草組成。大黃通滯瀉下、清熱解毒,甘草補中益脾、潤燥緩急。二者配伍用苦寒與甘平相結(jié)合,能清、能下、能通,解毒而不傷正。但大黃性味苦寒,攻勢峻猛。甘草味甘性平,有益氣補中,緩急止痛,調(diào)和藥性的作用。研究表明,甘草酸能阻止單用大黃引起的結(jié)腸劇烈收縮,緩解腹瀉開始時的腹痛。近年來中藥免煎顆粒劑在臨床上被廣泛采用。中藥免煎顆粒是以符合炮制規(guī)范的優(yōu)質(zhì)藥材為原料,按照中藥制劑制法,選用適當?shù)娜苊胶凸に?將中藥飲片中可溶性有效成分浸出,經(jīng)濃縮、干燥、制粒等工序制成的單味藥顆粒?；颊咴诜脮r按處方將單味藥顆粒劑混合服用,與傳統(tǒng)湯劑相比具有免煎易服、攜帶方便等優(yōu)點。但中藥復(fù)方中所含成分復(fù)雜,單煎與合煎時化學(xué)成分產(chǎn)生的相互作用不同,各成分溶出度量不同。蒽醌類化合物為大黃瀉下的主要成分(包括游離型和結(jié)合型),甘草的主要成分為甘草酸。中藥復(fù)方湯劑在煎煮過程中各味藥的成分會相互作用,使復(fù)方中的有效成分的溶出率發(fā)生變化。本實驗采用RP-HPLC法,測定了大黃甘草湯單煎與合煎液中主要有效成分蒽醌類化合物與甘草酸的煎出量的變化,為大黃甘草湯顆粒劑的研制提供實驗依據(jù),為研究中藥復(fù)方配伍提供參考。1藥品與成分配產(chǎn)品1100型高效液相色譜儀(美國Angilent公司,四元梯度泵,手動進樣,Angilent工作站);KDC21042低速離心機(科大創(chuàng)新公司);AE240十萬分之一電子天平(瑞士Mettler公司)。大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供);甘草酸對照品(西安富捷藥業(yè)有限公司,甘草酸含量>98.9%);色譜純甲醇(Fisher公司),其余試劑均為分析純。甘草飲片(產(chǎn)地:新疆),大黃飲片(產(chǎn)地:甘肅),均購自唐山市藥材公司。2方法和結(jié)果2.1通江縣貫徹落實樣品測定條件2.1.1蒽醌類化合物的測定條件:色譜柱:Angilent公司ZorboxSBC18(150mm×4.6mm);流動相:甲醇-水-冰醋酸(77∶22∶1);檢測波長:428nm;流速:1.0mL/min;柱溫:室溫。此條件下蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚分離良好。見圖1。2.1.2甘草酸的測定條件:色譜柱:迪馬C18(250mm×4.6mm);流動相:甲醇-水-冰醋酸(83.5∶15∶1.5);檢測波長:254nm;流速:1.0mL/min;柱溫:室溫。此條件下甘草酸分離良好。見圖2。2.2方法學(xué)研究2.2.1標準物質(zhì)和溶液的制備2.2.2標準曲線及線性回歸方程分別精密量取對照品貯備液0.10、0.20、0.30、0.50、0.80、1.00mL,置于10mL量瓶中,甲醇定容,20μL進樣測定。以蒽醌標準溶液濃度X對色譜峰面積Y進行線性回歸,得蒽醌類化合物的線性回歸方程。結(jié)果見表1。分別精確量取甘草酸對照品貯備液1.00mL,依次用甲醇稀釋至50、25、10、0.5、0.1mg/L,按上述色譜條件,分別依次進樣20μL測定。以甘草酸的濃度X對其峰面積Y進行線性回歸,得回歸方程,結(jié)果見表1。2.2.3算法2.2精密度試驗取同一濃度的對照品溶液連續(xù)進樣5次,測定峰面積,計算RSD,蘆薈大黃素為1.59%,大黃酸為0.71%,大黃素為0.72%,大黃酚為0.81%,表明該方法精密度良好。2.2.4大黃素和天麻酚的制備對同一提取液,按2.4項下樣品制備方法平行制備5份樣品溶液,測定峰面積,計算RSD,蘆薈大黃素為1.59%,大黃酸為1.79%,大黃素為1.01%,大黃酚為1.95%。2.2.5穩(wěn)定性試驗2.2.6加樣回收率試驗精密量取同一水煎液樣品6份,其中5份分別精確加入對照品,另一份作為測定本底值樣品用,各份均按2.4項下方法制備樣品,進樣20μL測定峰面積,計算回收率,結(jié)果見表2。2.3大黃甘草湯、單湯和湯的制備2.3.1單次萃取大黃的制備稱取大黃4.0g待用。于回流裝置中加入藥材量20倍的水加熱至沸,下大黃,回流提取25min后離心,即得大黃單煎液。2.3.2甘草單煎液的制備稱取甘草1.0g待用。于回流裝置中加入藥材量20倍的水加熱至沸,加入甘草回流提取40min后離心,上清液為甘草1g單煎液。同法制備甘草2g單煎液、甘草4g單煎液、甘草6g單煎液。2.3.3天麻甘草湯41合樹按處方比例準確稱取大黃4.0g,甘草1.0g待用。于回流裝置中加入藥材量20倍的水加熱至沸,下甘草,回流提取15min后,下大黃,再回流提取25min后離心,即得大黃甘草湯4∶1合煎液。稱取大黃4.0g,甘草2.0g,按上述方法操作,即得大黃甘草湯4∶2合煎液。稱取大黃4.0g,甘草4.0g,按上述方法操作,即得大黃甘草湯4∶4合煎液。準確稱取大黃4.0g,甘草6.0g,按上述方法操作,即得大黃甘草湯4∶6合煎液。2.4試驗中各成分的含量是試驗2.4.1游離供試品精密量取各煎液5.00mL于回流裝置中,加水10mL,加氯仿水浴回流提取3次(0.5h,20mL;0.5h,20mL;0.5h,10mL),分取氯仿層,合并氯仿提取液,水浴蒸干溶劑,殘渣用適量甲醇溶于10mL量瓶中,以甲醇定容,得游離蒽醌供試品。過0.45μm微孔濾膜后,20μL進樣測定,結(jié)果見表3。2.4.2結(jié)合型含量的測定精密量取大黃提取液5.00mL于回流裝置中,加水10mL,濃鹽酸2mL(使結(jié)合蒽醌水解為游離蒽醌),加氯仿水浴回流提取3次(1h,20mL;1h,20mL;0.5h,10mL),分取氯仿層,合并氯仿提取液,水浴蒸干溶劑,殘渣用適量甲醇溶解于10mL量瓶中,以甲醇定容,得總蒽醌供試品。過0.45μm微孔濾膜后,20μL進樣測定。結(jié)合型蒽醌含量=總蒽醌含量-游離型蒽醌含量。結(jié)果見表3。2.4.3甘草酸含量測定3甘草湯本品的制備工藝3.1實驗結(jié)果顯示大黃單煎及大黃甘草不同比例配伍后合煎,總蒽醌類化合物煎出量基本保持恒定,說明在大黃甘草湯中甘草對大黃中蒽醌類化合物煎出量影響不大。大黃與甘草配伍合煎時,甘草酸的煎出量卻發(fā)生了明顯的變化,合煎后煎煮液中甘草酸的含量均比單煎時得含量有明顯提高。按經(jīng)典方劑中大黃與甘草4∶1比例配伍合煎時,甘草酸的溶出量是單煎時的2.7倍。我們認為,大黃甘草合煎液中甘草酸含量的提高可能是因為合煎過程存在助溶作用,從而提高了甘草酸溶出率,是否有其它原因,有待進一步研究。甘草與大黃的比例量的從4∶1提高到4∶6,甘草酸的溶出率逐漸趨近于單煎時的溶出率。然而按經(jīng)典方劑的4∶1比例煎煮,可達到每克甘草溶出17.54mg,高于其他配伍比例,實驗結(jié)果說明大黃和甘草合煎優(yōu)于單煎。大黃甘草湯中藥免煎顆粒劑的制備應(yīng)采用大黃與甘草合煎的方式,可以大大地提高甘草酸的含量,節(jié)省甘草的用量,而此時大黃中的蒽醌類化合物的溶出量不會發(fā)生改變,保證了大黃甘草湯的藥效。3.2近年來,中藥免煎顆粒在醫(yī)療機構(gòu)的廣泛使用,引起了學(xué)術(shù)界的爭議,而爭議的焦點為“中藥合煎與單煎的差異性”。中藥復(fù)方并不是一個或幾個單體的簡單相加。本實驗證明大黃甘草湯使用時或制成顆粒劑時應(yīng)采用大黃與甘草合煎的方式制備,否則會降低甘草酸的含量,影響大黃甘草湯的藥效。精密稱取蘆薈大黃素1.99mg、大黃酸2.18mg、大黃素2.03mg、大黃酚2.06mg,置于10mL量瓶中,以甲醇定容,搖勻,即為蒽醌對照品貯備液。精密稱取甘草酸對照品1.00mg,置于1