產(chǎn)-氨基丁酸植物乳桿菌ndc75017培養(yǎng)基優(yōu)化研究

產(chǎn)-氨基丁酸植物乳桿菌ndc75017培養(yǎng)基優(yōu)化研究

0菌株的制備和發(fā)酵隨著人們生活水平的提高，山羊食品的消耗量逐年增加。在食品中添加抗生素的主要方法是直接添加抗生素或用無(wú)菌制劑添加。益生菌制劑制備的關(guān)鍵技術(shù)對(duì)乳酸菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)。限制乳酸菌高密度培養(yǎng)的主要因素是底物消耗和酸的積累。國(guó)外一些研究者對(duì)限制乳酸菌高密度培養(yǎng)的底物、緩沖鹽、生長(zhǎng)因子等做了大量研究。植物乳桿菌屬于乳酸桿菌屬,有很強(qiáng)的發(fā)酵碳水化合物的能力,耐膽鹽,免疫調(diào)節(jié),拮抗致病菌和抗突變等益生性質(zhì)。本研究采用的植物乳桿菌NDC75017分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中,具有許多益生功能。實(shí)驗(yàn)對(duì)影響菌體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境條件進(jìn)行了研究,提高了菌體活菌數(shù)和生物量,為乳酸菌發(fā)酵劑的制備奠定了基礎(chǔ)。1實(shí)驗(yàn)1.1培養(yǎng)基的制備植物乳桿菌NDC75017分離自內(nèi)蒙古通遼地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中。MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母粉5g,胰蛋白胨10g,Tween-801mL,葡萄糖20g,磷酸氫二鉀2g,檸檬酸氫二銨2g,乙酸鈉5g,硫酸鎂0.5g,硫酸錳0.25g,蒸餾水定容至1000mL,調(diào)pH值至5.8。121℃滅菌15min,用于菌體的活化。MRS固體培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂,121℃滅菌15min,用于菌體計(jì)數(shù)。增殖培養(yǎng)基:按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配方配制,121℃滅菌15min,用于菌體增殖培養(yǎng)。1.2u3000密封、蒸發(fā)與紫外分光光度BCN1360型生物潔凈工作臺(tái),GL-21M高速冷凍離心機(jī),滅菌鍋,DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱,精密天平與精密pH計(jì),紫外分光光度計(jì)DU800。1.3方法1.3.1蘑菇的激活從-80℃取出菌株復(fù)蘇純化,按2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中,30℃活化培養(yǎng)兩代。1.3.2碳源、氮源、緩沖鹽、生長(zhǎng)因子和培訓(xùn)條件的篩選將活化好的種子液按2%的比例分別接種至不同種類的碳源、氮源、緩沖鹽及不同的培養(yǎng)條件下(不同溫度、pH值)的培養(yǎng)基中。1.3.3活菌計(jì)數(shù)每隔2h取樣,將發(fā)酵液進(jìn)行10倍梯度稀釋,取10-7~10-9三個(gè)梯度進(jìn)行平板涂布,30℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)。1.3.4光光度計(jì)測(cè)定每隔2h取樣,發(fā)酵液的菌體密度用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600nm下測(cè)定。如果菌液過(guò)濃則稀釋一定倍數(shù)使光密度在0.2~1.2之間,菌體密度值為測(cè)定值乘以稀釋倍數(shù)。1.3.5r/min條件下離心10mim每隔2h取樣,發(fā)酵液在4000r/min條件下離心10mim。將得到的菌泥用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水洗滌三遍,70℃烘箱烘干至恒重。1.3.6ph測(cè)量每隔2h取樣,用精密pH計(jì)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的pH值。1.3.7葡萄糖質(zhì)量濃度的測(cè)定采用葡萄糖測(cè)定試劑盒(葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化氫酶法,上海榮盛生物藥業(yè)),每隔2h取樣測(cè)定菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中葡萄糖質(zhì)量濃度的變化。1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.4.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)篩選得到的對(duì)植物乳桿菌NDC75017生長(zhǎng)有顯著影響的因素:葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、檸檬酸氫二銨、乙酸銨、乙酸鈉、Tween80、硫酸鎂和硫酸錳10個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素取2個(gè)水平,高水平(+1)為低水平(-1)的1.5倍,以植物乳桿菌的菌體濃度為響應(yīng)值。1.4.2最陡峭邊坡的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選得到的影響菌體濃度的顯著影響因素確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和梯度,確定試驗(yàn)因素的中心點(diǎn)。1.4.3gn-oppert響應(yīng)面設(shè)計(jì)根據(jù)1.4.1和1.4.2確定的試驗(yàn)因素和中心點(diǎn),采用Design-Expert軟件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì),將得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,得到一個(gè)響應(yīng)變量與自變量之間的模型。根據(jù)建立的模型計(jì)算得到植物乳桿菌NDC75017最佳增殖培養(yǎng)基配方。1.4.4普通mrs培養(yǎng)基和響應(yīng)面培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)將活化好的種子液按2%的比例分別接種至普通MRS培養(yǎng)基和1.4.3響應(yīng)面設(shè)計(jì)的增值培養(yǎng)基中,30℃靜置培養(yǎng)。每隔2h取樣測(cè)定發(fā)酵液的活菌數(shù)及干重。1.5數(shù)據(jù)分析與研究實(shí)驗(yàn)過(guò)程每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。采用DesignExpert17.0設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析;采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異分析;數(shù)據(jù)計(jì)算、繪圖采用MicrosoftExcel2003軟件。2結(jié)果與分析2.1不同ph值、葡糖的濃度對(duì)酵母粉質(zhì)量濃度的影響植物乳桿菌NDC75017的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖1可以看出,菌體生長(zhǎng)至12h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期,此時(shí)活菌數(shù)最高達(dá)到6.48×1010mL-1;菌體整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中,發(fā)酵液中的pH值從5.8下降到3.4,葡糖的質(zhì)量濃度從16.6g/L下降到1.2g/L。另外,從圖中可以明顯看出,當(dāng)菌體生長(zhǎng)到18h時(shí)活菌數(shù)迅速下降,可能原因是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如碳源的消耗和pH值的下降(主要是菌體代謝葡萄糖產(chǎn)生乳酸造成的)造成菌體活力下降,并出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象。2.2復(fù)合氮源、緩沖溶液和培養(yǎng)基由圖2~圖5可以看出,對(duì)植物乳桿菌NDC75017有明顯促進(jìn)作用的碳源為葡萄糖,氮源為酵母粉、牛肉膏和胰蛋白胨,緩沖鹽為檸檬酸氫二銨和乙酸銨,生長(zhǎng)因子為硫酸錳、硫酸鎂和Tween80。有研究者研究證明復(fù)合氮源比單一氮源更有利于乳酸菌的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)選用酵母粉、牛肉膏和胰蛋白胨為植物乳桿菌NDC75017生長(zhǎng)的復(fù)合氮源。2.3培養(yǎng)基中各微量元素的含量對(duì)發(fā)酵條件的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選因素編碼及水平如表1和表2所示。由表1和表2可以看出,每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案下植物乳桿菌NDC75017活菌數(shù)的變化。表3是根據(jù)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程選取的每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素效應(yīng)大小進(jìn)行分析的結(jié)果。由表3可以看出,X1(葡萄糖)、X6(乙酸銨)2個(gè)因素的效應(yīng)為負(fù),表明因素X1(葡萄糖)、X6(乙酸銨)對(duì)菌體濃度的影響為負(fù)效應(yīng),即隨著培養(yǎng)基中葡萄糖、乙酸銨含量的增加,活菌數(shù)呈下降趨勢(shì);其余因素的效應(yīng)為正,均為正效應(yīng)。其中葡萄糖、檸檬酸氫二銨、乙酸銨和硫酸錳的P值均小于0.05,表明這三個(gè)因素對(duì)活菌數(shù)的影響顯著。而檸檬酸氫二銨、乙酸銨在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中均起到緩沖鹽的作用,為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方便,這里只選取檸檬酸氫二銨作為培養(yǎng)基中的緩沖鹽。故采用葡萄糖、檸檬酸氫二銨和硫酸錳這3個(gè)因素為主要研究對(duì)象做后續(xù)研究,利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定三個(gè)因素的最佳濃度范圍。2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選得到的顯著影響因素的效應(yīng)大小確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和梯度(見(jiàn)表4)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn),根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素的中心點(diǎn)。由表4可以看出,隨著葡萄糖質(zhì)量濃度降低,檸檬酸氫二銨和硫酸錳濃度的升高,活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì),活菌最高的響應(yīng)值區(qū)域在第四組實(shí)驗(yàn)。故響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素的中心點(diǎn)為葡萄糖15g/L,檸檬酸氫二銨3.5g/L,硫酸錳0.4g/L。2.5回歸方程和模型建立分析根據(jù)2.3和2.4實(shí)驗(yàn)篩選得到的對(duì)菌體生長(zhǎng)有顯著影響的因素葡萄糖、檸檬酸氫二銨、硫酸錳和由最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素中心點(diǎn),采用DesignExpert17.0軟件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。表5是以葡萄糖、檸檬酸氫二銨、硫酸錳3個(gè)因素為自變量,植物乳桿菌NDC75017活菌數(shù)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方案。表6是根據(jù)表5設(shè)計(jì)方案得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。根據(jù)表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過(guò)Design-Expert17.0軟件處理確定回歸方程:Y=6.65+0.39X1+0.013X2+0.19X3+0.11X1X2-0.100X1X3+0.0073X2X3-0.77X12-0.43X22-0.44X32,式中:Y為植物乳桿菌NDC75017菌體濃度的預(yù)測(cè)響應(yīng)值;X1為葡萄糖的編碼值;X2為檸檬酸氫二銨的編碼值;X3為硫酸錳的編碼值?；貧w方程方差分析如表7所示。由表7可以看出,經(jīng)Design-Expert17.0軟件分析,所建立的模型Prob>F值為0.0012小于0.01表明建立的模型影響極顯著;模型失擬項(xiàng)Prob>F為0.0632,大于0.05,即失擬項(xiàng)不顯著,說(shuō)明本試驗(yàn)建立的模型在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合度較好,接近真實(shí)的響應(yīng)曲面情況,模型建立合理;CV(變異系數(shù))表示模型的精確度,本研究模型中CV=3.83%,較低,說(shuō)明模型精確度高,結(jié)果可信。模型的決定系數(shù)R2=94.51%,矯正系數(shù)R2Adj=87.46%,表明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間具有高度相關(guān)性,能解釋87.46%的響應(yīng)值變化,故可以利用此模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)植物乳桿菌NDC75017的菌體濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)。從響應(yīng)面分析可知,回歸模型存在最大值。根據(jù)Design-Expert17.0軟件得到的回歸方程可計(jì)算得到Y(jié)的最大估計(jì)值為6.72×1010mL-1,此時(shí)葡萄糖16.31g/L、檸檬酸氫二銨3.52g/L,硫酸錳0.41g/L。2.5響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最大活菌數(shù)的測(cè)定圖7為優(yōu)化前后細(xì)胞生物量的變化,經(jīng)優(yōu)化后細(xì)胞干重由原來(lái)的3.31g/L提高到3.93g/L,細(xì)胞干重提高了原來(lái)的1.2倍。圖8為優(yōu)化前后細(xì)胞活菌數(shù)的變化,經(jīng)優(yōu)化后,最大活菌數(shù)由原來(lái)的3.15×1010mL-1提高到6.48×1010mL-1,活菌數(shù)提高了2.1倍。且活菌數(shù)與響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最大活菌數(shù)6.72×1010mL-1接近。說(shuō)明回歸方程能夠真實(shí)的反映篩選因素對(duì)植物乳桿菌NDC75017生長(zhǎng)的影響,對(duì)于培養(yǎng)基的優(yōu)化研究具有指導(dǎo)意義。3最大活菌數(shù)和細(xì)胞干重實(shí)驗(yàn)通過(guò)Plackett-Burman法、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)植物乳桿菌培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。確定了植物乳桿菌增值的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖16.31g/L,酵母粉7.5g/L,胰蛋白胨15g/L,牛肉膏7.5g/L,檸檬酸氫二銨3.52