高效液相色譜法

第十八章高效液相色譜法Highperformanceliquidchromatography陳睿婷高效液相色譜

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備分離效率高、選擇性好、分析速度快、檢測(cè)器靈敏度高、操作自動(dòng)化和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。液相色譜1、按流動(dòng)相與固定相的分子聚集狀態(tài)分類

流動(dòng)相固定相氣體(gas,G)液體(liguid,L)超臨界流體(supercrtticalfluid,SF)固體(solid,S)GSCLSCSFSC液體(liguid,L)GLCLLCSFLC化學(xué)鍵合相(bondedphase,BP)GBPCLBPCSFBPC氣相色譜液相色譜超臨界色譜按固定相分類按分離機(jī)理分類液固色譜法化學(xué)鍵合色譜法分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法分子排阻色譜法手性色譜法親合色譜法膠束色譜法HPLC高效液相色譜法的分類液液色譜法高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法。1、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別2、HPLC與GC差別3、高效液相色譜儀流程圖4、特點(diǎn)一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段經(jīng)典LCHPLC柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm

且不均勻常壓輸送流動(dòng)相柱效低（H↑，n↓）分析周期長(zhǎng)無法在線檢測(cè)柱內(nèi)徑2~10mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）

高壓輸送流動(dòng)相(40-50MPa)柱效高（H↓，n↑）分析時(shí)間大大縮短

可以在線檢測(cè)二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)主要差別：分析對(duì)象的差別、流動(dòng)相的差別、操作條件差別GCHPLC

能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品。高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測(cè)。占有機(jī)物的20%

溶解后能制成溶液的樣品。不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)用途廣泛，占有機(jī)物的80%GCHPLC流動(dòng)相的差別和操作條件差別流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無親合作用力，只與固定相作用操作條件：常壓，加溫操作流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度起很大作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相可以增大分離選擇性操作條件：室溫、高壓程序升溫梯度洗脫液相色譜的基本流程圖流動(dòng)相泵色譜柱檢測(cè)器泵輸液分離檢測(cè)

計(jì)算機(jī)AEGBCDF進(jìn)樣閥進(jìn)樣預(yù)備柱①②③④⑤高效液相色譜儀流動(dòng)相脫氣裝置泵檢測(cè)器六通閥美國(guó)Agilent美國(guó)Waters日本島津常用的高效液相色譜儀4.2.2高效液相色譜主要部件(1)泵輸液系統(tǒng)——a，高壓輸液泵主要部件之一，壓力可達(dá)40MPa，有的可達(dá)100MPa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相(<10μm)，液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)，脈沖小，流量穩(wěn)定可調(diào)，耐腐蝕等特性。雙柱塞往復(fù)泵優(yōu)點(diǎn)：消除脈動(dòng)

恒流量b,梯度淋洗裝置高壓梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。低壓梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。混合和加壓的順序先加壓后混合先混合后加壓(2)進(jìn)樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥其結(jié)構(gòu)如下：loadinject注射器吸取的樣品量必須大于定量環(huán)的量。手動(dòng)進(jìn)樣：自動(dòng)進(jìn)樣：用于大量在同樣操作條件下分離的類似樣品反相HPLC極性:固定相<流動(dòng)相

固定相-極性弱

流動(dòng)相(甲醇,乙腈等)-極性強(qiáng)

極性大物質(zhì)先出峰正相HPLC 極性:固定相>流動(dòng)相

固定相-極性強(qiáng)

流動(dòng)相(己烷,庚烷)-極性弱

極性小物質(zhì)先出峰正相色譜20%反相色譜80%正相色譜20%反相色譜80%主流（3）色譜柱分離的核心部分物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度固定相-填充材料的物理性質(zhì)鍵合類型碳覆蓋率封端化學(xué)性質(zhì)鍵合固定相的化學(xué)性質(zhì)通用型示差折光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器專屬型熒光檢測(cè)器固定波長(zhǎng)可變波長(zhǎng)光電二極管陣列安培檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器紫外/可見光檢測(cè)器1.要求

靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、響應(yīng)快、死體積小、對(duì)溫度和流速變化不敏感（4）、檢測(cè)器目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器測(cè)量通過溶液后的紫外或可見光光強(qiáng)度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測(cè)物的最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)時(shí)靈敏度最大a.紫外檢測(cè)器朗伯—比爾定律優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)這種檢測(cè)器簡(jiǎn)單、可靠可以作梯度實(shí)驗(yàn)并且是非破壞性的大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以，線性范圍較寬；

對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感

波長(zhǎng)可選，易于操作

不是所有化合物都有吸光度，不是通用檢測(cè)器

對(duì)某些化合物的檢測(cè)靈敏度不及其他檢測(cè)器

樣品中不同化合物的最大吸收波長(zhǎng)不同時(shí)，需要使用多波長(zhǎng)檢測(cè)，或使用折衷的波長(zhǎng)受流動(dòng)相組成的影響：

用截止波長(zhǎng)以上至少5～10nm作為工作波長(zhǎng)

緩沖鹽、離子對(duì)試劑、胺改性劑也會(huì)有影響背景吸收的影響背景吸收降低了線性范圍多數(shù)流動(dòng)相有紫外吸收實(shí)際濃度理想10吸光度210背景吸收溶劑名稱紫外截止波長(zhǎng)/nm正己烷190二硫化碳380四氯化碳265苯210氯仿245二氯甲烷233四氫呋喃212丙酮330乙腈190甲醇205水187光電二極管陣列檢測(cè)器

80年代出現(xiàn)的一種新型檢測(cè)器。單晶硅上密集排列一系列光電二極管，一個(gè)光電二極管對(duì)應(yīng)接受光譜上一個(gè)譜帶寬度的單色光。例如，安捷倫1100HPLC光電二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)范圍為200～900nm對(duì)應(yīng)1024個(gè)光電二極管，平均0.7nm譜帶寬度由一個(gè)光電二極管接收。三維紫外圖時(shí)間——波長(zhǎng)——吸光度光學(xué)分辨率（帶寬）好的光譜分辨率可得到高質(zhì)量的光譜信息230.00250.00270.00nmBenzene3.0nmvs

1.0nm

損失分辨率，UV最大波長(zhǎng)移動(dòng)

1.0nm3.0nm190nm5.0nm優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)通用的UV/Vis檢測(cè)好的選擇性、線性提供色譜峰的UV/Vis光譜圖（峰指認(rèn)）可提供純度估計(jì)低光學(xué)通量（較窄的帶寬通量）與普通UV/Vis相比更復(fù)雜，容易漂移燈輸出能量隨時(shí)間降低S2*S1*S0T1*紫外可見吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光體系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l4

外轉(zhuǎn)換l

3振動(dòng)能級(jí)電子能級(jí)熒光：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長(zhǎng)為

‘2的熒光；10-7～10-9s。b.熒光檢測(cè)器

特點(diǎn)：

高靈敏度，高選擇性。對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B，黃曲霉素，卟啉類化合物，農(nóng)藥，藥物，氨基酸，甾類化合物等有響應(yīng)。定量關(guān)系：熒光檢測(cè)器的應(yīng)用環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸生物技術(shù)及制藥氨基甲酸酯類殺蟲劑黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）維生素?zé)晒鈾z測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)選擇性提高靈敏度提高（在pg/fg范圍）低背景技術(shù)mV-0.100.000.100.200.300.400.50Minutes5.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.006.8949.639200pgExcitation

=280Emission=360熒光檢測(cè)器的缺點(diǎn)不是所有化合物都有熒光，有的需要衍生化檢測(cè)器對(duì)溶解氣體及其他淬滅物質(zhì)（如甲醇）敏感對(duì)Ex及Em的最佳，易受溫度、溶劑的極性和粘度、溶劑的pH值及樣品濃度影響多數(shù)儀器的批次間差異較大，同一型號(hào)的不同熒光檢測(cè)器會(huì)得到不同的結(jié)果。C、安培檢測(cè)器適用于：氧化還原活性的物質(zhì)，如：胺、酚、羰基、巰基化合物原理：電極施加恒電位，當(dāng)電活性成分經(jīng)過時(shí)，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流。流速一定時(shí)，與流動(dòng)相中的濃度有關(guān)。特點(diǎn)：靈敏度高，適合痕量物質(zhì)檢測(cè)d、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器用氮?dú)饬鲃?dòng)相混合噴霧形成小液滴，通過一個(gè)加熱的腔體除去流動(dòng)相，溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動(dòng)相，因此產(chǎn)生氣溶膠，進(jìn)入檢測(cè)室光照后，氣溶膠發(fā)生光散射散射光由光電倍增管檢測(cè)散射光強(qiáng)度與溶質(zhì)的存在量呈比例關(guān)系應(yīng)用領(lǐng)域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制藥行業(yè)表面活性劑天然產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)不能使用不揮發(fā)性的流動(dòng)相（例如：磷酸鹽）要求使用霧化氣源（典型的是氮?dú)猓┎煌纳V條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化蒸發(fā)出的溶劑要通到戶外或通風(fēng)櫥里對(duì)揮發(fā)性化合物的檢測(cè)不理想一般得到的是非線性校正曲線某些化合物的檢測(cè)靈敏度不如其他檢測(cè)器通用型－比流動(dòng)相揮發(fā)性小的物質(zhì)都能被檢測(cè)可以作梯度實(shí)驗(yàn)；檢測(cè)下限可到納克級(jí)水平對(duì)環(huán)境條件不敏感；可以使用有強(qiáng)紫外吸收的溶劑作流動(dòng)相e.示差折光檢測(cè)器

除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器。

可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折射率差值。差值與濃度成正比。

通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）。

靈敏度低，對(duì)溫度敏感，不能用于梯度洗脫。

偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種。應(yīng)用范圍：碳水化合物、聚合物、脂肪酸及油脂類f、色質(zhì)聯(lián)用m/z+/-電離源質(zhì)量分析器MS： 質(zhì)譜（MassSpectrometry）是一種按照分子量及其電荷分離物質(zhì)的技術(shù)，。LC/MS：液相色譜與質(zhì)譜的連用。過程：除去HPLC的溶劑；產(chǎn)生離子；分離離子；檢測(cè)離子；計(jì)算離子強(qiáng)度；處理數(shù)據(jù)色質(zhì)聯(lián)用儀器色譜質(zhì)譜常用電離源：電子轟擊源(EI)、電噴霧源(ESI)、大氣壓化學(xué)電離源(APCI)、大氣壓光電離（APPI）、基質(zhì)輔助電離（MALDI）常用質(zhì)量分析器：四級(jí)桿、離子阱、磁質(zhì)譜、飛行時(shí)間質(zhì)譜常用檢測(cè)器：電子倍增器、光電倍增器電離源1、電噴霧電離源（ESI）電離源2、大氣壓化學(xué)電離源（APCI）和大氣壓光電離（APPI）MolecularWeightAnalytePolarityverypolarnonpolar100,00010,0001,000APCIESILC-MS的離子產(chǎn)生200300400500600700800m/z529527233489543APCI(-):40V100200300400500m/z5797147219278515530EI

同一種物質(zhì)在不同的離子源中，可能產(chǎn)生不同的帶電離子，進(jìn)而產(chǎn)生不同的信號(hào)。APCI和ESI是液質(zhì)聯(lián)用常用的離子源，EI是氣質(zhì)聯(lián)用常用的離子源。020406080100120Time[min]0200Intens.mAUUVChromatogram,360nm020406080100120Time[min]0.00.51.07x10Intens.總離子流圖液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)示例：石墨電弧富勒烯產(chǎn)物分析HPLC固定相液－固吸附色譜固定相(吸附劑）液—液分配色譜固定相1、液—固色譜固定相1.硅膠無定形多孔硅膠、球形全多孔硅膠、堆積硅珠2.氧化鋁⑴球形(5～10μm)；⑵無定形(5～10μm)。3.高分子微孔多球(有機(jī)膠)4.其它：⑴分子篩；⑵聚酰胺等。固定相分類涂漬（幾乎不用）化學(xué)鍵合相（常用）鍵合反應(yīng)：目前使用的化學(xué)鍵合相主要為硅氧烷（Si-O-Si-C)型鍵合，以氯硅烷與硅膠進(jìn)行硅烷化反應(yīng)制得。以O(shè)DS為例：化學(xué)鍵合相一般鍵合相代號(hào)：YWG-C18H37載體鍵合基團(tuán)1、非極性鍵合相：

C18柱(ODS)是最常用的非極性鍵合相。常用的還有C8柱、C1柱、苯基柱、芘基柱等。2.弱極性鍵合相：常見的有醚基鍵合相、二羥基鍵合相。極性鍵合相：強(qiáng)極性－氨基鍵合相(分析糖類)；中強(qiáng)極性－氰基鍵合相。化學(xué)鍵合相類型硅膠鍵合C18柱填料

化學(xué)鍵合相一般用硅膠作載體，具有分配作用和一定的吸附作用。吸附作用的大小視覆蓋度或含碳量而定。用化學(xué)反應(yīng)方法將載體表面上殘存的硅醇基除去，稱為封尾，所形成的鍵合相稱為封尾鍵合相，完全封尾的鍵合相無吸附作用，缺點(diǎn)是疏水強(qiáng)。特點(diǎn)：①、化學(xué)穩(wěn)定性好，使用過程不易流失，柱壽命長(zhǎng)；②、均一性和重現(xiàn)性好③、柱效高，分離選擇性好；④、適于作梯度洗脫。⑤、載樣量大；注意事項(xiàng)：①、在pH2~8的溶液不變質(zhì)，過酸過堿，硅膠溶解；②、不同廠家不同批次性質(zhì)可能略有不同。流動(dòng)相對(duì)分離的影響依據(jù)分離方程式討論溶劑系統(tǒng)對(duì)分離度的影響n：由色譜柱填充質(zhì)量決定；α：溶劑種類影響k：溶劑配比影響溶劑的種類不同，分子間的作用力的性質(zhì)、強(qiáng)度不同，選擇性不同。在溶劑種類確定以后，配比的調(diào)整改變極性，改變洗脫能力，從而改變保留時(shí)間，而分子間作用力的性質(zhì)不變，因此主要是改變?nèi)萘恳蜃觡。流動(dòng)相選擇

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí)，首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。

也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。

常用溶劑的極性順序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)溶劑選擇性分組根據(jù)接收質(zhì)子，給予質(zhì)子和偶極作用，常用溶劑分為八類。同一組的溶劑作用力類型相似，在色譜中具有相似的選擇性，不同組的溶劑，選擇性差異較大。溶劑配比對(duì)保留時(shí)間的影響例：C18柱檢測(cè)甲硝唑含量溶劑：水：甲醇水：甲醇50:5070:3080:203min5min6min反向色譜：溶劑極性越小，洗脫力越強(qiáng)，保留時(shí)間約短。梯度洗脫梯度洗脫的實(shí)質(zhì)：是通過不斷地變化流動(dòng)相的濃度配比，來調(diào)整混合樣品中各組分的K值。用于分離組分性質(zhì)差別較大的復(fù)雜樣品。優(yōu)點(diǎn)：①縮短分析周期；②提高分離效果；③改善峰形，很少拖尾；④增加檢測(cè)靈敏度。甲醇：水30:70甲醇：水80:20時(shí)間甲醇水00100208020高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。流動(dòng)相溶劑的選擇將直接影響組分的分離度.1.基本要求⑴溶劑必須具有合適的極性和良好的選擇性(相對(duì)于待測(cè)樣品)，⑵溶劑要與檢測(cè)器匹配，對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)；溶劑名稱紫外截止波長(zhǎng)/nm正己烷190二硫化碳380四氯化碳265苯210氯仿245二氯甲烷233四氫呋喃212丙酮330乙腈190甲醇205水187流動(dòng)相溶劑的選擇基本理論和條件選擇熱力學(xué)理論：塔板理論——平衡理論

動(dòng)力學(xué)理論：速率理論——Vander方程

一、塔板理論二、速率理論三、HPLC法中分離條件的選擇HPLC與經(jīng)典LC和GC在基本原理、概念和方法基本上相同，主要差別是流動(dòng)相的性質(zhì)不同。因此，某些公式的表現(xiàn)形式或參數(shù)的含意有些差別。

色譜柱長(zhǎng)：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為保留時(shí)間包含死時(shí)間，在死時(shí)間內(nèi)不參與分配!理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為n=L/H塔板理論根據(jù)色譜速率理論方程式：渦流擴(kuò)散項(xiàng)分子擴(kuò)散項(xiàng)傳質(zhì)阻抗項(xiàng)H=A+B/u+Cu液相色譜速率理論產(chǎn)生原因：載氣攜樣品進(jìn)柱，遇到來自固定相顆粒的阻力→路徑不同→渦流擴(kuò)散影響因素：固體顆粒越小，填充越實(shí)，A項(xiàng)越小，柱效越高。1、渦流擴(kuò)散項(xiàng)A填充物的填充不規(guī)則因子填充物的平均直徑提高柱效方法：①、降低固定相粒徑dp(3-10μm)②、降低不規(guī)則因子λ(RSD<5%,球形填料)產(chǎn)生原因：待測(cè)組分在柱中存在著濃度差，從而產(chǎn)生縱向擴(kuò)散。2、分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u（縱向擴(kuò)散）彎曲因子擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散系數(shù)Dm與流動(dòng)相黏度η成反比，與溫度成正比，HPLC中，流動(dòng)相是液體，黏度遠(yuǎn)大于氣體，操作溫度多為室溫，因此Dm約為GC的10-5倍，且流速多在最佳流速以上，分子擴(kuò)散項(xiàng)很小，可忽略。3、傳質(zhì)阻抗項(xiàng)Cu固定相傳質(zhì)阻抗靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗

液相傳質(zhì)過程指組分從氣液界面擴(kuò)散進(jìn)入固定液，擴(kuò)散至固定液深部，達(dá)到分配平衡，再回到氣液界面的過程。固定相粒度越小，傳質(zhì)阻力越小。流動(dòng)相黏度越小，組分?jǐn)U散系數(shù)越大，傳質(zhì)阻力越小。流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗1）Cs固定相傳質(zhì)阻抗

由試樣分子從固定液表面進(jìn)入固定液內(nèi)并回到表面，進(jìn)行質(zhì)量交換的傳質(zhì)過程產(chǎn)生。Cs為一常數(shù)，與容量因子有關(guān)，df為液膜的厚度，Dl試樣分子在固定相中的擴(kuò)散系數(shù)。改善方法：采用薄的固定相液膜，且固定液粘度小。在液液分配色譜中，由于多用化學(xué)鍵合固定相，固定液只是在載體表面的一單分子層，因此Cs可忽略

2）流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗

當(dāng)流動(dòng)相攜帶樣品分子流過色譜柱的填充物時(shí)，處于流路邊緣的流動(dòng)相（即靠近填充物顆粒），流動(dòng)得較慢，而流路中心的流動(dòng)相流動(dòng)較快，還未與固定相達(dá)到平衡就被沖出，在柱內(nèi)流動(dòng)相的流速不均勻，組分分子遷移速率不同，引起峰擴(kuò)展。由色譜柱填充情況決定。填料顆粒越小，擴(kuò)散系數(shù)越大，則Cm越小。3）靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗

由于固定相中擔(dān)體的多孔性，在固定相中微孔內(nèi)流動(dòng)相稱為滯流流動(dòng)相，一般是停滯不動(dòng)。當(dāng)組分的部分分子進(jìn)入滯留流動(dòng)相，再進(jìn)行分配，相對(duì)較晚回到流路，引起峰展寬。由于孔有一定深度，擴(kuò)散到孔中的路徑不同，微孔小而深，傳質(zhì)阻力就大，對(duì)峰擴(kuò)展的影響就越大。Csm與固定相結(jié)構(gòu)粒度和流動(dòng)相擴(kuò)散系數(shù)有關(guān)。⑴速率方程在GC中的表現(xiàn)形式⑵速率方程在HPLC的表現(xiàn)形式：流動(dòng)相流速提高，柱效降低。但是柱效變化不如氣相大。填充柱：毛細(xì)管柱：無渦流擴(kuò)散，A=0不同色譜下的速率方程分析型柱子（內(nèi)徑4.6mm)：流速一般為1mL/min3145uHPLCGCH圖20－2流動(dòng)相的流速對(duì)GC與HPLC板高影響對(duì)比2流動(dòng)相流速提高，柱效降低。但是柱效變化不如氣相大。分析型柱子（內(nèi)徑4.6mm)：流速一般為1mL/min固定相粒度：A,Cs,Csm隨粒度邊小而變小，且粒度越小，柱效受流速影響越小，因此采用小顆粒填料。根據(jù)速率理論，HPLC的實(shí)驗(yàn)條件為：①、小顆粒、均勻的球形化學(xué)鍵合相。②、低粘度流動(dòng)相，流速不宜過快。③、柱溫適當(dāng)，多為室溫。按固定相分類按分離機(jī)理分類液液色譜法LLC液固色譜法LSC分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法分子排阻色譜法化學(xué)鍵合色譜法親合色譜法手性色譜法HPLC高效液相色譜法的分類化學(xué)鍵合色譜法化學(xué)鍵合相：將具有官能團(tuán)的固定相鍵合到載體表面，構(gòu)成化學(xué)鍵合相?；瘜W(xué)鍵合色譜法：以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合色譜法(bondphasechromtography，BPC)。正相化學(xué)鍵合相色譜法、反相化學(xué)鍵合相色譜法一、正相鍵合相色譜法

固定相：如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羥基鍵合硅膠。流動(dòng)相：非極性或弱極性溶劑（烴類）加極性調(diào)整劑（醇類）適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。分離選擇性：鍵合相種類、流動(dòng)相種類、試樣性質(zhì)。分離機(jī)制？

有的認(rèn)為是分配作用，有的認(rèn)為是吸附作用。分配：把有機(jī)鍵合層作為一個(gè)液膜看待，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配，極性強(qiáng)的成分，K大，tR大吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作用。二、反相鍵合相色譜法固定相：非極性鍵合相，如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠流動(dòng)相：水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)整劑，常用甲醇－水、乙腈－水等應(yīng)用：

最廣，非極性至中等極性的組分，（還有有機(jī)酸、堿及鹽等）分離機(jī)理：

反相鍵合相表面具有非極性烷基官能團(tuán)和未被取代的硅醇級(jí)。分離機(jī)理較復(fù)雜，主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力。圖10-4疏水劑締合示意圖保留行為的主要影響因素：1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）

極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大。

同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大；

引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。

2、固定相

鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長(zhǎng)而增加，溶質(zhì)的k也增大。C18分離效果好，C8，C1用于快速分離。

硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)的k越大。3、流動(dòng)相

極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大

溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強(qiáng)溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大中性鹽的加入：使中性溶質(zhì)的k增大pH：影響弱酸、弱堿的離解程度，解離程度越高，與流動(dòng)相