藥物的體外抗菌試驗(yàn)

第二十章藥物的體外抗菌試驗(yàn)藥物的體外抗菌試驗(yàn)〔antimicrobialtestinvitro〕是在體外測(cè)定微生物對(duì)藥物敏感程度的實(shí)驗(yàn)，已廣泛地應(yīng)用于科研、生產(chǎn)和臨床。如：抗菌藥物的篩選、提取過(guò)程中的追蹤、抗菌譜的測(cè)定、藥物含量的測(cè)定、藥物濃度的測(cè)定、指導(dǎo)臨床用藥的藥敏實(shí)驗(yàn)等?？咕鷮?shí)驗(yàn)包括抑菌實(shí)驗(yàn)和殺菌實(shí)驗(yàn)。1精選課件抑菌：即抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，但不能殺死微生物，在藥物除去后微生物又能生長(zhǎng)；殺菌：即能殺死微生物，當(dāng)藥物除去后，微生物也不能再生長(zhǎng)繁殖。兩者并非絕對(duì)，只是在一定條件下相對(duì)而言。2精選課件

第一節(jié)常用的體外抑菌實(shí)驗(yàn)

體外抑菌實(shí)驗(yàn)是最常用的抗菌實(shí)驗(yàn)，方法簡(jiǎn)便，需時(shí)短，用藥量少，不需要?jiǎng)游锖吞厥庠O(shè)備，一般在玻璃器皿中進(jìn)行。常用的方法有連續(xù)稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法。3精選課件一、連續(xù)稀釋法〔serialdilutiontest〕〕可用于測(cè)定藥物的最低抑菌濃度〔MIC〕和最低殺菌濃度〔MBC〕?？梢杂靡后w培養(yǎng)基，也可用固體培養(yǎng)基。1、液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法在一系列試管中，將液體培養(yǎng)基按一定的倍數(shù)稀釋藥物，獲得藥物濃度遞減的系列試管，然后在每一管中參加定量實(shí)驗(yàn)菌，經(jīng)培養(yǎng)一定時(shí)間后，肉眼觀察試管混濁情況，記錄抑制實(shí)驗(yàn)菌生長(zhǎng)的最低濃度〔即MIC〕。4精選課件

圖20-1液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法

5精選課件2、固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法分平板法和斜面法。1〕平板法可同時(shí)測(cè)定大批實(shí)驗(yàn)菌株的MIC，且不受藥物顏色及混濁度的影響，適于中藥制劑或評(píng)價(jià)新藥的藥效學(xué)〔藥物的體外抗菌活性測(cè)定〕實(shí)驗(yàn)。將系列濃度的藥物混入瓊脂培養(yǎng)基，使制成一批藥物濃度呈系列遞減的平板。然后將含有一定細(xì)胞數(shù)的實(shí)驗(yàn)菌液〔通常為104左右〕以點(diǎn)接種法接種于平板上，可以逐個(gè)點(diǎn)種，也可采用多點(diǎn)接種器接種；同時(shí)設(shè)無(wú)藥空白平板對(duì)照。培養(yǎng)后觀察結(jié)果。6精選課件2〕斜面法

是固體培養(yǎng)基上連續(xù)稀釋法的一種，是將系列濃度的各藥分別混入固體培養(yǎng)基中制成斜面，在斜面上接種一定量的實(shí)驗(yàn)菌，然后觀察是否有菌生長(zhǎng)，判斷MIC值。7精選課件二、瓊脂擴(kuò)散法〔agardiffusiontest〕

是利用藥物可以在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散，在藥物有效濃度的范圍內(nèi)形成抑菌圈或抑菌距離，以抑菌圈直徑或抑菌距離的大小來(lái)評(píng)價(jià)藥物抗菌作用強(qiáng)弱的原理設(shè)計(jì)而成，具有各種不同的方法。常用的有以下幾種：8精選課件1、濾紙片法瓊脂擴(kuò)散法中最常用方法適用于新藥的初篩實(shí)驗(yàn)〔初步判斷藥物是否與抗藥作用〕及臨床的藥敏實(shí)驗(yàn)〔細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)，以便選擇用藥〕，可進(jìn)行多種藥物或一種藥物不同濃度對(duì)同一種實(shí)驗(yàn)菌的抗菌實(shí)驗(yàn)。首先將實(shí)驗(yàn)菌均勻混入瓊脂培養(yǎng)基，制成含菌平板，然后將一定大小的濾紙片蘸取藥液置于平板上，培養(yǎng)后即可觀察結(jié)果。根據(jù)抑菌圈直徑的大小，評(píng)價(jià)藥物抗菌作用的強(qiáng)弱。9精選課件

WHO于1981年曾推薦Kirby-Bauer法〔k-B法〕作為標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏實(shí)驗(yàn)。k-B法根本原理是濾紙片法，但需用統(tǒng)一的培養(yǎng)基、菌液濃度、紙片質(zhì)量、紙片含藥量以及其他實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果判斷以卡尺精確量取，根據(jù)抑菌圈的直徑大小判斷該菌對(duì)藥物是抗藥、中等敏感或敏感。2、打孔法10精選課件

2、打孔法在含瓊脂平板上打孔，孔內(nèi)參加藥液，經(jīng)培養(yǎng)后可產(chǎn)生一定大小的抑菌圈。適于藥物血濃度的監(jiān)測(cè)，血清用量少，敏感性高，操作簡(jiǎn)便。

3、挖溝法先制備瓊脂平板，在平板上挖溝，溝的兩邊垂直劃線接種各種實(shí)驗(yàn)菌，再在溝內(nèi)參加藥液。培養(yǎng)后根據(jù)溝兩邊所生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)菌離溝的抑菌距離來(lái)判斷對(duì)這些菌的抗菌效力。適用于在一個(gè)平板上實(shí)驗(yàn)一種藥物對(duì)幾種實(shí)驗(yàn)菌的抗菌作用。H:\其他--中藥婦炎樂(lè)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果11精選課件

第二節(jié)殺菌試驗(yàn)

一、最低殺菌濃度或最低致死濃度的測(cè)定殺菌實(shí)驗(yàn)用以評(píng)價(jià)藥物對(duì)微生物的致死活性。最低殺菌濃度指該藥物能殺死細(xì)菌的最低濃度。從對(duì)微生物廣義而言，也可稱之為最低致死濃度〔MLC〕。一般是將待檢藥物先以適宜的液體培養(yǎng)基在試管內(nèi)進(jìn)行連續(xù)稀釋，每管內(nèi)再參加一定量的試驗(yàn)菌液，培養(yǎng)后可得該藥物的MIC，取MIC終點(diǎn)以上未長(zhǎng)菌的各管培養(yǎng)液，分別移種于另一無(wú)菌平板上圖20-1，培養(yǎng)后凡平板上無(wú)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度即為該藥物的MBC〔或MLC〕12精選課件

MBC〔或MLC〕的含義也可定義為在一定條件下，使絕大多數(shù)微生物被殺死，但允許有最少量微生物存活的藥物最低濃度。

據(jù)此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，在藥物連續(xù)稀釋后，每管內(nèi)參加定量實(shí)驗(yàn)活菌液〔105-106細(xì)菌/ml〕。培養(yǎng)后從肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的試管內(nèi)各取培養(yǎng)液0.1ml或0.01ml涂布于平板上測(cè)定存活菌數(shù)，以使99.9%微生物致死的藥物最低濃度為MLC，即在一定條件下，存活的菌數(shù)不多于原始接種數(shù)的0.1%.13精選課件二、活菌計(jì)數(shù)法〔viablecountingmethod〕是在一定濃度的定量藥物內(nèi)參加定量的實(shí)驗(yàn)菌，作用一定時(shí)間后，取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，從存活的微生物數(shù)計(jì)算出藥物對(duì)微生物的致死率?；罹?jì)數(shù)的方法：一般是取實(shí)驗(yàn)菌與藥物作用后的混合液，經(jīng)稀釋后取定量混入瓊脂培養(yǎng)基，傾注成平板。培養(yǎng)后計(jì)數(shù)長(zhǎng)出的菌落數(shù)或菌落形成單位〔CFU〕。再乘以稀釋倍數(shù)，即可得藥物稀釋后每毫升內(nèi)存活的細(xì)菌數(shù)或CFU。如果藥物作用后，存活菌數(shù)很少，也可采用微孔濾膜過(guò)濾法測(cè)定。14精選課件三、石炭酸系數(shù)測(cè)定法〔phenolcoefficient〕又稱酚系數(shù)法，是以石炭酸為標(biāo)準(zhǔn)，在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下，作用一定時(shí)間，將待測(cè)的化學(xué)消毒劑與石炭酸對(duì)傷寒沙門菌或金黃色葡萄球菌的殺菌效力相比較，所得殺菌效力的比值。石炭酸系數(shù)是了解消毒劑殺菌效力的一種方法。石炭酸系數(shù)=消毒劑的殺菌稀釋度/石炭酸的殺菌稀釋度石炭酸系數(shù)大于或等于2為合格。15精選課件

舉例：將石炭酸準(zhǔn)確稀釋為1：90、1：100，、、等；待測(cè)消毒劑準(zhǔn)確稀釋1：150、1：170、、、。分別取上述稀釋液各5ml〔10ml〕參加一系列無(wú)菌試管中，置于20℃恒溫水浴，使反響保持在20℃以下進(jìn)行。各管內(nèi)再參加傷寒沙門菌培養(yǎng)液各0.5ml,立即開始準(zhǔn)確計(jì)時(shí),在加菌后5、10、15分鐘，分別從管中取一接種環(huán)的混合液接種于一支5ml〔或10ml〕的肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察并記錄結(jié)果。+為有菌生長(zhǎng)，-為無(wú)菌生長(zhǎng)。16精選課件

表20-1石炭酸系數(shù)測(cè)定

濃度作用時(shí)間

51015石炭酸1:90---1:0+--1:10++-消毒劑1:150---1:170---1:200---1:225---1:250+--1:275++-17精選課件

根據(jù)5分鐘不能殺菌，10分鐘能殺菌的最大稀釋度為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算，那么石炭酸系數(shù)=250/100=2.5

或根據(jù)三個(gè)相同殺菌結(jié)果的稀釋度比值的平均值來(lái)計(jì)算,那么:石炭酸系數(shù)=(225/90+250/100+275/110)/3=2.5石炭酸系數(shù)愈大,那么被測(cè)消毒劑的效力愈高.但石炭酸系數(shù)的應(yīng)用有一定局限性,因?yàn)槟骋幌緞?duì)傷寒沙門菌的石炭酸系數(shù)的大小并不能完全代表它對(duì)其他細(xì)菌作用的強(qiáng)弱.18精選課件另外,石炭酸系數(shù)法還有以下缺點(diǎn):1)有機(jī)物存在時(shí)消毒劑失去活性;2)消毒劑可能對(duì)組織有毒性;3)隨溫度變化而影響測(cè)定結(jié)果;4)只適用于同類消毒劑的殺菌效力測(cè)定,對(duì)非酚類、季銨鹽及不穩(wěn)定的次氯酸鹽等均不能給予正確評(píng)價(jià).19精選課件

第三節(jié)聯(lián)合抗菌試驗(yàn)

在藥學(xué)中，常需要檢查兩種抗菌藥物在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的相互作用以及抗菌藥物與不同PH值或不同離子溶液的相互影響。加強(qiáng)藥物抗菌作用的為協(xié)同〔synergism〕；減弱藥物作用的為拮抗〔antagonism〕；互相無(wú)影響的為無(wú)關(guān)〔indifference〕；作用二者之和為累加〔addition〕。20精選課件

聯(lián)合抗菌試驗(yàn)的常用方法一、紙條試驗(yàn)〔paperstriptest〕即在已接種實(shí)驗(yàn)菌的平板外表垂直放置兩條浸有一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強(qiáng)、減弱或無(wú)影響來(lái)判斷它們?cè)诼?lián)合應(yīng)用時(shí)的效應(yīng)。圖20-2是紙條實(shí)驗(yàn)的示意圖。

21精選課件

圖20-2是紙條實(shí)驗(yàn)的示意圖。圖中A列的兩紙條中只有一條含有抗菌藥物，另一條不含抗菌藥物；B列的兩紙條均含有抗菌藥物。

22精選課件二、梯度平板紙條試驗(yàn)

〔paperstrip-gradientplatetest〕需先制備含藥的梯度平板。梯度平板的制備是先將瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，平皿斜置待凝，再將平板放置水平，參加含抗菌藥物的瓊脂培養(yǎng)基。在重疊的雙層平板中含有梯度濃度的抗菌藥物，自高濃度〔+〕至低濃度〔-〕依次遞減。要求其抑菌濃度的位置約處于平板的一半。將實(shí)驗(yàn)菌懸液涂布于平板外表，取濾紙條浸透另一待檢藥液，按梯度平板中藥物濃度遞減的方向置于平板外表。培養(yǎng)后，如待檢藥液對(duì)平板的藥物有加強(qiáng)作用，那么可見(jiàn)紙條兩端的抑菌區(qū)被擴(kuò)大。23精選課件

圖20-3紙條梯度平板試驗(yàn)24精選課件三、棋盤格法〔checkboardtest〕是由于在試驗(yàn)時(shí),含兩種不同濃度藥物的試管排列呈棋盤狀而得名,用以評(píng)價(jià)兩種藥物同時(shí)用不同濃度進(jìn)行聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)的抗菌活性。實(shí)驗(yàn)時(shí)排列6排試管，每排6管，共36管使成方塊，A及B藥各以液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，A藥各稀釋度縱行定量參加各管，B藥各稀釋定量按橫排參加，兩藥同時(shí)作單獨(dú)抗菌實(shí)驗(yàn)對(duì)照。然后參加定量菌液，經(jīng)培養(yǎng)后觀察結(jié)果。25精選課件棋盤格法的結(jié)果用局部抑菌濃度〔FIC〕及FIC指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。FIC：又稱聯(lián)合抑菌分?jǐn)?shù)，指某一藥在聯(lián)合前后所測(cè)得的MIC比值。如二待測(cè)藥為A、B，那么FIC〔A〕=A藥與B藥聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)A藥的MICA藥單獨(dú)試驗(yàn)時(shí)的MICFIC〔B〕=B藥與A藥聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)B藥的MICB藥單獨(dú)試驗(yàn)時(shí)的MIC所謂FIC指數(shù)，指二藥各自的FIC之和，即FIC指數(shù)=FIC〔A〕+FIC〔B〕

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FIC指數(shù)小于1，兩藥有協(xié)同作用，即兩藥聯(lián)合較單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的抑菌作用為強(qiáng)。FIC指數(shù)的值愈小，那么聯(lián)合抗菌作用愈強(qiáng)。如20-2

如20-2FIC指數(shù)與聯(lián)合抗菌效應(yīng)

FIC指數(shù)聯(lián)合抗菌效應(yīng)小于0.75協(xié)同

1累加