麻痹性貝毒的研究進展

麻痹性貝毒的研究進展

pvc毒素的檢測近年來，世界上有害浪潮的頻發(fā)、程度和影響呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，并給人類健康、水產養(yǎng)殖和生態(tài)系統(tǒng)帶來了嚴重的破壞。赤潮的主要危害之一是某些赤潮藻類能夠產生毒素,毒素通過食物鏈進入貝體內,人們食用染有貝毒的貝類后造成中毒甚至死亡。赤潮毒素的毒性各異,根據(jù)毒素對人類引發(fā)的中毒癥狀和藻源,可分為麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)、腹瀉性貝毒(diarrheticshellfishpoisoning,DSP)、神經性貝毒(neurotoxicshellfishpoisoning,NSP)、記憶缺失性貝毒(amnesiashellfishpoisoning,ASP)和西加魚毒(ciguatera)等,其中以PSP分布最廣,危害最大。我國4大海域均有檢出。PSP毒素是一類神經肌肉麻醉劑,與興奮膜上的電壓門控Na+通道位點的氨基酸殘基高度親和,通過選擇性阻斷Na+內流,抑制動作電位的形成,造成神經系統(tǒng)傳輸障礙。PSP對酸、熱穩(wěn)定,一般的食品加工很難破壞其毒性,中毒后死亡率非常高,其中石房蛤毒素毒性是眼鏡蛇毒素的80倍。更嚴重的是,這類毒素目前尚無對癥的解毒劑。因此,國內外對PSP的檢測,特別是PSP毒素的快速篩查技術尤為重視。目前國際上有關PSP的調查、檢測多采用小鼠法和HPLC。小鼠法雖然快捷,能給出樣品的毒性,但需大量的小鼠,花費大、耗時、靈敏度低、假陽性高、受待檢樣品量和標準活體動物的限制,用于批量樣品的檢測尚不夠理想。HPLC對樣品預處理條件要求很高,費用昂貴,且標準品問題難以有效解決,更重要的不能及時有效、準確地反映樣品的實際毒性,因而也不理想。利用電壓敏感染料(Voltagesensitivedye)光學記錄膜電位是電生理研究中的一項嶄新技術,具有非介入性,高度時間、空間分辨力的特點。應用電壓敏感染料對記錄細胞或組織進行一定的染色,當膜電位變化時,作為分子轉換器,電壓敏感染料隨膜電位的變化在膜表面出現(xiàn)熒光或吸光變化,這些光學變化被探測系統(tǒng)記錄,從而獲得膜電位變化的信息。Bis-oxonol是一種慢反應電壓敏感染料,潘雅萍等利用Bis-oxonol建立了一種適用于高通量的鉀通道調節(jié)劑快速篩選方法。Russell等根據(jù)PSP毒素能夠抑制藜蘆定誘導神經突觸體去極化作用的原理,利用對電壓敏感的熒光玫瑰精探針檢測神經突觸體膜電壓的變化用于PSP的檢測。由于該方法直接利用了毒素的毒理特征,能真正反映樣品的實際毒性,且靈敏度高、操作簡單、方便,對儀器的要求不高,因此是一種頗有潛力的貝毒篩選方法。但由于小鼠突觸體的制備比較復雜,影響和限制了其推廣和應用。為克服這一缺點,本文擬選擇易培養(yǎng)且鈉通道豐富的膀胱癌移行細胞T24,采用Bis-oxonol建立一種以細胞為基礎的、基于毒素毒理特征的、用于PSP毒素檢測的電壓敏感熒光染料測定法。1實驗部分1.1ympus分布CO2培養(yǎng)箱(美國Themro),F-4500熒光分光光度計(日本Hitachi),超凈工作臺(蘇州),倒置顯微鏡(日本Olympus),電熱恒溫鼓風干燥箱(南京),低速離心機(Dopont),電子天平,血球計數(shù)板。胎牛血清(杭州四季青公司),DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(杭州吉諾公司),胰蛋白酶(上海生工),熒光染料Bis-oxonol,藜蘆定(Veratridine)和短桿菌肽(Gramicidin)(Sigma公司),GTX2,3由暨南大學理工學院江天久研究員提供,其他試劑為分析純。1.2樣品采集和處理膀胱癌移行細胞系T24購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心;昆明系雄性小鼠,體重16～20g,由暨南大學實驗中心提供;貝類購自廣州市黃沙海產品批發(fā)市場,共5種,分別為海灣扇貝(Argopectenirradians)、華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)、翡翠貽貝(Pernaviridis)、毛蚶(Scapharcasubcrenata)、西施舌(Coelomactraantiquata)。樣品采集后,迅速送至實驗室,洗凈外殼泥沙,將肉與殼分離。對于海灣扇貝和華貴櫛孔扇貝,將其消化腺剪下單獨保存,將處理的樣品立即放入-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?.3dmem/fps2細胞培養(yǎng)將T24細胞接種于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2d換一次液,待細胞生長至對數(shù)生長期時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。1.4moll-1的誘導酶熒光測定參照Louzao的方法。取適量細胞密度為2.5×105cells·mL-1的細胞懸液加入至1mL的比色杯中,依次加入終濃度為4nmol·L-1的Bis-oxonol、40μmol·L-1的藜蘆定和一定濃度的GTX2,3毒素標準品,使毒素的終濃度分別為2,20,40,80和100ng·mL-1,最后加入10μg·mL-1短桿菌肽。對照組加入雙蒸水。于激發(fā)波長530nm,發(fā)射波長560nm,狹縫5.0nm,流速1200nm·min-1條件下測定熒光,計算GTX2,3對熒光強度的抑制率,繪制抑制率與毒素濃度間的關系曲線。1.5sdp的制備取適量貝肉,瀝凈多余水分,勻漿。取100g于燒杯中,加入100mL0.18mol·L-1鹽酸溶液,攪拌均勻,調節(jié)pH2.0～4.0,徐徐煮沸5min,充分攪拌。冷卻至室溫,再次調節(jié)pH2.0～4.0,于4000r·min-1離心5min,取上清液,即得PSP粗提掖。采用上述熒光染料測定法和小鼠生物測定法測定毒素含量。小鼠生物測定采用AOAC(associationofofficialanalyticalchemists)推薦的“麻痹性貝毒小鼠測定法”進行,結果以鼠單位(MU·g-1)表示,1個小鼠單位是指使1只體重20g小鼠在5min內死亡的毒素的量,相當于0.18μgSTX。2結果與分析2.1降低精準裝樣中bis-o體等的熒光強度于細胞懸液中加入Bis-oxonol、藜蘆定和一定濃度的GTX2,3后,細胞熒光強度的變化曲線如圖1所示?？梢钥闯?加入Bis-oxonol后細胞熒光強度趨于不變;加入藜蘆定誘導細胞去極化后,熒光強度迅速增加;加入GTX后,熒光強度明顯降低;加入短桿菌肽使細胞完全去極化,熒光強度再次升高。表明毒素GTX的加入可有效改變細胞的熒光強度。由于Bis-oxonol在細胞內外的分散具有電壓依賴性,達到能斯特平衡后,加入藜蘆定誘導細胞去極化。鈉通道開放,Na+內流,陰離子染料Bis-oxonol被釋放到細胞膜表面,膜表面染料濃度增加,熒光增強。加入鈉通道的阻斷劑GTX2,3,降低藜蘆定誘導的去極化,Bis-oxonol又進入細胞內,細胞膜表面染料濃度降低,熒光強度也會降低。最后加入短桿菌肽使細胞完全去極化,熒光強度再次升高。2.2劑量-效應曲線圖2為熒光強度與GTX2,3濃度的關系?？梢钥闯?加入不同濃度GTX時,細胞熒光強度發(fā)生不同程度的降低,熒光強度的變化與GTX之間存在明顯的劑量-效應關系。進一步計算GTX2,3對熒光強度的抑制率,繪制抑制率與毒素濃度間的關系曲線,如圖3?？梢钥闯?毒素濃度在2～100ng·mL-1之間時,抑制率與GTX的濃度呈明顯的的線性關系,R2達0.98,說明可以利用PSP毒素對藜蘆定誘導細胞去極化的抑制作用來測定毒素的含量。2.3stx毒力較高市售貝類PSP毒素的檢測結果如表1所示。由于不同的毒素毒力有顯著不同,為便于比較,表1中將小鼠法和熒光法測定結果均換算成STX毒力,1MU相當于0.18～0.22μgSTX,1μgGTX2,3相當于0.76μgSTX?？梢钥闯?兩種方法的檢測結果基本一致,熒光檢測法比小鼠檢測法檢出限更低,靈敏度更高,小鼠法的檢出限只有160ngSTX·mL-1,相當于210ngGTX·mL-1,而熒光檢測法的最低檢測限為2ng·mL-1。3sd-4-ccs-o地位法檢測麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoison,PSP)是目前世界上分布最廣、危害最嚴重的一類貝毒,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多種衍生物,按其取代基不同可分為四種類型:(1)氨基甲酸酯類毒素(Carbamatetoxins),包括石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)、新石房蛤毒素(NeoSTX)和膝溝藻毒素1-4(Gonyautoxins,GTX1-GTX4)等;(2)N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfocarbamoyltoxins),包括B1-B2和C1-C4等;(3)脫氨甲酰基類毒素(Decarbamoyltoxins),包括dcSTX、dcneoSTX和dcGTX1-4等;(4)脫氧脫氨甲?；惗舅?Deoxydecarbamoyltoxins),包括doSTX和doGTX2-3。不同毒素的毒力大小不同,毒力大小依次為:STX>dcSTX=neoSTX>GTX1,4>dcneoSTX>GTX2,3>dcGTX2,3>GTX5。由于PSP毒素屬于劇毒品,可作為化學武器,國際上限制流通,因此標準品的獲得非常困難。另外,新的PSP毒素衍生物的不斷發(fā)現(xiàn)提示以HPLC為代表的成分分析法會存在毒素漏檢的情況,因此很難準確反映樣品的實際毒性。其他方法如MS-LC、毛細管電泳檢測技術相對于傳統(tǒng)的液相色譜技術有了一定的改進,但這些方法需要昂貴的儀器設備,樣品前處理復雜,也存在類似HPLC的問題。免疫檢測法方便、迅速,但價格高,偶聯(lián)難度大且存在交叉反應,不能完全體現(xiàn)出樣品的毒性。本文以膀胱癌移行細胞T24為材料,采用熒光探針Bis-oxonol,借助PSP毒素阻塞鈉通道的特性,建立了一種以毒素毒理特征為基礎的PSP毒素熒光測定法。實驗結果顯示,毒素濃度在2～100ng·mL-1之間時,熒光強度的抑制率與GTX的濃度呈明顯的線性關系,表明利用PSP毒素對藜蘆定誘導細胞去極化的抑制作用來測定毒素的含量是可行的。為進一步說明這一問題,我們分別用本方法和小鼠生物測定法測定了市售貝類中的PSP毒素,并進行了比較。結果表明,兩種方法檢測結果基本相同,與文獻對相關貝類的檢測結果基本一致。與小鼠法相比,熒