抗軟海綿酸單克隆抗體的制備與鑒定

抗軟海綿酸單克隆抗體的制備與鑒定

腹瀉性核毒（sd）是由紅藻和原甲藻產(chǎn)生的脂肪多環(huán)醚類天然化合物。主要營養(yǎng)成分是軟海綿酸（oa）及其衍生物。引起的人類中毒的癥狀包括腹瀉、惡心嘔吐和胃痛。腹瀉性核毒的主要成分是軟海綿酸（oa）及其衍生物。引起的人類中毒的癥狀包括腹瀉、惡心嘔吐和胃痛。腹瀉性核毒是由磷酸酯酶刺激引起的。這是蛋白質(zhì)磷酸酶pp1a和pp2a的強(qiáng)抑制劑。這是一種很強(qiáng)的致癌促癌劑，可以增加胃腸道腫瘤的形成。目前,腹瀉性貝毒的分析方法主要有生物小鼠法、高效液相色譜法、以及一些免疫化學(xué)方法。生物小鼠法簡便易行,不需要儀器設(shè)備,但不能區(qū)別毒素的種類和結(jié)構(gòu)、干擾大、不精確;高效液相色譜分析法可準(zhǔn)確給出毒素的含量和種類,檢測(cè)限可低至ng/g,已被許多國家采用為標(biāo)準(zhǔn)方法,缺點(diǎn)是樣品前處理繁瑣費(fèi)時(shí),儀器昂貴,且需要專門的分析技術(shù)人員;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)利用抗體對(duì)抗原的特異性結(jié)合,加入酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記的二抗,經(jīng)底物顯色,用紫外或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定的免疫化學(xué)方法,具有靈敏度高,特異性強(qiáng),儀器設(shè)備簡單易掌握,樣品前處理相對(duì)簡單等優(yōu)點(diǎn),適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)和大量樣本快速篩查,近年在分析化學(xué)領(lǐng)域受到極大的重視和迅速發(fā)展。本研究用軟海綿酸與牛血清白蛋白和卵清蛋白偶聯(lián)制備免疫抗原和包被抗原,用其免疫小鼠制備單克隆抗體,建立了貝類中軟海綿酸殘留量的間接競爭ELISA分析方法。1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)和抗鼠二抗amol-1333,5e培養(yǎng)基BALB/c小鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;軟海綿酸、水溶性碳化二亞胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carboimidehydrochloride,EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)、弗氏完全和不完全佐劑、HAT(hypoxanthineaminopterinthymidinemedium)培養(yǎng)液、胎牛血清、聚乙烯醇(polyvinylalcohol,PVA)、聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)均購自Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)標(biāo)記羊抗鼠二抗購自華美公司。所用儀器Thermolabsystems酶標(biāo)儀和洗板機(jī)、JASCO紫外/可見分光光度計(jì)V-550。1.2方法1.2.1偶聯(lián)物摩爾分子比的測(cè)定將軟海綿酸(OA)溶于1ml的二甲基亞砜中,加入EDC和NHS,25℃反應(yīng)1.5h后,加入溶于硼酸鹽緩沖液(pH9.0)的牛血清白蛋白(BSA),25℃反應(yīng)3h。將反應(yīng)混合物移入透析卡中透析3天,4℃,每12h換液1次。通過測(cè)定反應(yīng)前后的自由氨基數(shù),得到偶聯(lián)物的摩爾分子比。透析物分裝后,-20℃保存。OA-OVA偶聯(lián)方法相同。1.2.2小鼠sda的合成以O(shè)A-BSA為免疫原,免疫兩只6~8周齡的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用200μlOA-BSA與等體積弗氏完全佐劑,充分乳化,腹腔注射小鼠,第2、4、6、8、10和12周取同量OA-BSA與等體積不完全弗氏佐劑充分乳化,腹腔注射。取尾血測(cè)定小鼠血清效價(jià),待效價(jià)大于要求值后,融合的前4天,取100μgOA-BSA的PBS溶液腹腔注射加強(qiáng)免疫。1.2.3酶標(biāo)羊抗鼠二抗h7.4用OA-OVA偶聯(lián)物作為包被抗原,用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋到適當(dāng)濃度添加到96孔酶標(biāo)板,每孔100μl,4℃過夜;棄去殘液,洗滌96孔酶標(biāo)板(洗液PBST:1%吐溫-20溶于pH7.4的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液)3次;用1%的PVA-PBS溶液300μl封閉,37℃3h;封閉好的96孔酶標(biāo)板可保存在4℃數(shù)周待用;測(cè)定時(shí),棄去封閉液,洗板3次,加入稀釋的血清或細(xì)胞上清,每孔100μl,37℃溫箱中孵育1h;從溫箱中取出酶標(biāo)板,洗板,加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)羊抗鼠二抗,每孔100μl;37℃溫箱中孵育40min;洗板,每孔加底物溶液(鄰苯二胺、pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液和30%H2O2,臨用前現(xiàn)配制)100μl,37℃顯色10~15min,以0.5mol/LH2SO4每孔50μl中止反應(yīng),492nm波長測(cè)量吸光度值。1.2.4peg融合添加量取生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期骨髓瘤SP2/0細(xì)胞(2×107/ml)與免疫的小鼠脾細(xì)胞(1×108/ml)按1∶5的比例混合,加入PEG融合;在20%胎牛血清的HAT培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng),3天后換半液,5~7天有細(xì)胞克隆形成,取細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行ELISA檢測(cè),選取陽性細(xì)胞孔,用有限稀釋法克隆,篩選可穩(wěn)定分泌抗軟海綿酸(OA)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。1.2.5雜交瘤細(xì)胞術(shù)檢測(cè)強(qiáng)陽性孔的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3~4次有限稀釋法克隆培養(yǎng),用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清,至陽性率達(dá)到100%,所得細(xì)胞株即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后,部分細(xì)胞用含10%二甲基亞砜的完全培養(yǎng)液懸浮,液氮保存,其它細(xì)胞轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。1.2.6雜交瘤細(xì)胞懸液的制備取8周齡健康BALB/c雌性小鼠,腹腔注射0.5ml液體石蠟,1~2周后可用;1500r/min離心收集對(duì)數(shù)生長期的陽性雜交瘤細(xì)胞,懸浮于生理鹽水中,加適量青霉素和鏈霉素,懸浮細(xì)胞濃度為106/ml;在石蠟處理的小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml雜交瘤細(xì)胞懸液;注射后7~10天可見小鼠腹部明顯膨大,用大號(hào)針頭刺入小鼠腹部,收集腹水,3000r/min離心10min,收集上清液即為含單克隆抗體腹水,用間接ELISA法測(cè)定腹水效價(jià),-85℃凍存待用。1.2.7elisa-4-3-ms-elisa反應(yīng)將陽性雜交瘤細(xì)胞的腹水做系列稀釋,用ELISA方陣確定最佳稀釋濃度;將OA-OVA偶聯(lián)物用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋到適當(dāng)濃度,以100μl/孔包被酶標(biāo)板,4℃過夜;1%PVA-PBS封閉后,每孔加入適當(dāng)濃度的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶解于0.01mol/LpH7.4的PBS)和稀釋的腹水各50μl,其余步驟同ELISA分析血清方法;中止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測(cè)定492nm吸光值。以加入不同濃度OA標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光值與空白對(duì)照孔吸光值比(結(jié)合率)為縱坐標(biāo),相應(yīng)的OA標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.8甲醇-水萃取法將一定量的軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)品添加到扇貝肉中,80%的甲醇-水萃取,用上述間接競爭ELISA法檢測(cè)樣品中OA的含量。實(shí)測(cè)值與實(shí)際OA添加量相除,即為樣品的回收率。2結(jié)果2.1a與載蛋白質(zhì)結(jié)合的分子比根據(jù)自由氨基測(cè)定的結(jié)果,OA與BSA和OVA的結(jié)合比分別是27∶1和12∶1。2.2免疫大鼠血清效果以O(shè)A-BSA為免疫抗原,免疫8次的兩只BALB/c小鼠的血清對(duì)OA-OVA的效價(jià)均大于2×104。2.3陽性混合腫瘤的細(xì)胞株2.3.1elisa篩選取免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,每只鼠滴種8塊96孔板,融合率達(dá)到90.1%,經(jīng)ELISA篩選,陽性率為2.2%。3次克隆后分別獲得4株陽性雜交瘤細(xì)胞株,命名為Mab13#、Mab10#、Mab11#和Mab7#,經(jīng)過細(xì)胞體外連續(xù)傳代十幾代及凍存2個(gè)月后復(fù)蘇,ELSIA效價(jià)檢測(cè)顯示抗體分泌仍呈強(qiáng)陽性,效價(jià)與原代細(xì)胞一致,證明這4株雜交瘤具有穩(wěn)定分泌抗體的能力。2.3.2雜交瘤抗體的制備擴(kuò)大培養(yǎng)后,細(xì)胞上清液的滴度見表1,結(jié)果表明雜交瘤能分泌較高濃度的單克隆抗體。通過小鼠體內(nèi)誘生的方法,4株雜交瘤細(xì)胞均能誘導(dǎo)出高效價(jià)的含抗OA單克隆抗體的腹水,其滴度結(jié)果見表2。2.4間接競爭法分析2.4.1ova的稀釋度及使用濃度用點(diǎn)陣法確定了競爭ELISA法包被抗原OA-OVA最佳稀釋度是1∶1000;腹水的稀釋倍數(shù)是1∶6000;HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗的使用濃度為1∶1000;底物顯色的時(shí)間為12min。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以抗原OA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),結(jié)合率為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。OA濃度與其結(jié)合率之間有較好的線性關(guān)系,r=0.9824,最低檢出限為31.2ng/ml。2.4.3elisa方法的回收率取一定量的OA標(biāo)準(zhǔn)液,添加到扇貝肉中,加入萃取液,使其終濃度分別為50、83.3和125ng/ml,用建立的間接競爭ELISA方法測(cè)定萃取液中OA的濃度。50ng/ml濃度測(cè)定6次的平均回收率為88.3%,83.3ng/ml濃度測(cè)定4次的平均回收率為87.2%,125ng/ml濃度測(cè)定5次的平均回收率為112.3%;50ng/ml濃度測(cè)定6次的變異系數(shù)為7%,83.3ng/ml濃度測(cè)定4次的變異系數(shù)為12%,125ng/ml濃度測(cè)定5次的變異系數(shù)為5.4%。3elisa檢測(cè)對(duì)于抗腹瀉性貝毒的主要成分軟海綿酸單克隆抗體的成功制備并應(yīng)用于OA的分析檢測(cè),可能因?yàn)檐浐＞d酸分子量相對(duì)較小,分子結(jié)構(gòu)是長鏈狀,分子內(nèi)可以用來與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)的功能基團(tuán)少,合成高質(zhì)量的人工抗原較困難;OA標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴,來源渠道少,限制了關(guān)于建立ELISA分析方法的研究。本實(shí)驗(yàn)成功的合成了OA和BSA、OVA偶聯(lián)的2種抗原,分別用做免疫抗原與檢測(cè)抗原,本文利用制備的單克隆抗體建立了OA間接競爭ELISA分析方法,可用于海洋貝類中OA的