雙脫氧末端終止法測(cè)序

PAGEPAGE5快速序列測(cè)定：雙脫氧末端終止法06級(jí)生科A班蘇狄064120202摘要：核酸的序列分析，即核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)中一項(xiàng)重要技術(shù)。目前應(yīng)用的兩種快速序列測(cè)定技術(shù)是Sanger等（1977年）提出的雙脫氧鏈終止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化學(xué)降解法，其中雙脫氧鏈終止法是目前應(yīng)用最多，最好的技術(shù)。關(guān)鍵詞：快速序列測(cè)定、雙脫氧末端終止法目前應(yīng)用的兩種快速序列測(cè)定技術(shù)是Sanger等（1977）提出的酶法（雙脫氧鏈終止法）和Maxam（1977）提出的化學(xué)降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都同樣生成相互獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點(diǎn)，卻隨機(jī)終止于一種（或多種）特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸為末端的長(zhǎng)度各不相同的寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長(zhǎng)度由這個(gè)特定堿基在待測(cè)DNA片段上的位置所決定。然后通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)放射自顯影后，從放射自顯影膠片上直接讀出待測(cè)DNA上的核苷酸順序。高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳亦是DNA序列測(cè)定技術(shù)的重要基礎(chǔ)，可分離僅差一個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度達(dá)300~500個(gè)核苷酸的單鏈DNA分子。DNA序列測(cè)定的簡(jiǎn)便方法為詳細(xì)分析大量基因組的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，時(shí)至今日，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)氨基酸序列都是根據(jù)基因或cDNA的核苷酸序列推導(dǎo)出來(lái)的。除傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法和化學(xué)降解法外，自動(dòng)化測(cè)序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。此外，新的測(cè)序方法亦在不斷出現(xiàn)，如上世紀(jì)90年代提出的雜交測(cè)序法（sequencingbyhybridization，SBH）等。雙脫氧末端終止法測(cè)序一、原理雙脫氧末端終止法是Sanger等在加減法測(cè)序的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的。其原理是：利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，以單鏈DNA為模板，并以與模板事先結(jié)合的寡聚核苷酸為引物，根據(jù)堿基配對(duì)原則將脫氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基團(tuán)與引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯鍵。通過(guò)這種磷酸二酯鍵的不斷形成，新的互補(bǔ)DNA得以從5′→3′延伸。Sanger引入了雙脫氧核苷三磷酸（ddTNP）作為鏈終止劑。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一個(gè)羥基（2′,3′-ddNTP）（圖7-4-1），可以通過(guò)其5′三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長(zhǎng)的DNA鏈中，但由于缺少3′-OH，不能同后續(xù)的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯鍵。因此，正在增長(zhǎng)的DNA鏈不再延伸，使這條鏈的延伸終止于這個(gè)異常的核苷酸處。這樣，在4組獨(dú)立的酶反應(yīng)體系中，在4種dNTP混合底物中分別加入4種ddNTP中的一種后，鏈的持續(xù)延伸將與隨機(jī)發(fā)生卻十分特異的鏈終止展開競(jìng)爭(zhēng)，在摻入ddTNP的位置鏈延伸終止。結(jié)果產(chǎn)生4組分別終止于模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)C、每個(gè)G和每一個(gè)T位置上的一系列長(zhǎng)度的核苷酸鏈。通過(guò)高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從放射自顯影膠片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理如圖7-4-2所示。圖7-4-1脫氧核苷三磷酸和雙脫氧核苷三磷酸分子結(jié)構(gòu)55′GAGTCACACTTGAC——3′待測(cè)單鏈DNA33′CTG—5′引物、Klenow酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和少量α-32P-dATP濃度的dNTP的較低溫度，以便將合成反應(yīng)限制在適度之下并確保放射性標(biāo)記dNTP和較低溫度，以便將合成反應(yīng)限制在適度之下并確保放射性標(biāo)記dNTP的有效摻入，這步反應(yīng)的產(chǎn)物是僅僅延伸了20-30堿基的引物。再將第一步反應(yīng)等分于4組1套的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)系統(tǒng)中，每組反應(yīng)中都含有高濃度的dNTP和一種ddNTP。這樣聚合反應(yīng)就得以繼續(xù)，直至造成鏈終止的核革酸摻入正在增長(zhǎng)的鏈中。（4）TaqDNA聚合酶：適用于測(cè)定在37℃形成大段穩(wěn)定十級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈DNA模板序列。這是因?yàn)門aqDNA聚合酶在70-75℃活性最高，這一溫度下即使GC豐富的模板也無(wú)法形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。按照1nnis等（1988）介紹的方法使用TaqDNA聚合酶進(jìn)行測(cè)序，在放射自顯影片上得到的測(cè)序梯連續(xù)數(shù)百個(gè)堿基條帶始終清晰如一，表明這種酶的持續(xù)合成能力甚佳。模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)G或每一個(gè)T的位置上。模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)G或每一個(gè)T的位置上。循環(huán)測(cè)序法利用了熱循環(huán)儀的自動(dòng)循環(huán)的高效能力。循環(huán)測(cè)序反應(yīng)與普通PCR反應(yīng)有所不同。只需一條引物，通過(guò)單引物進(jìn)行熱循環(huán)，模板DNA以線性方式被擴(kuò)增，而不是標(biāo)準(zhǔn)PCR的指數(shù)方式擴(kuò)增；反應(yīng)底物除四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，還加入了雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，鏈的延伸終止于摻入ddNTP的位置，產(chǎn)生分別終止于不同核苷酸的一系列不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段。（四）放射性標(biāo)記的dNTP傳統(tǒng)的DNA測(cè)序方法都采用α-32P-dNTP作為放射性標(biāo)記物，但由于32P發(fā)射的高能β射線，常會(huì)引起二個(gè)問(wèn)題。首先是導(dǎo)致放射自顯影圖譜條帶擴(kuò)散、分辨率低，限制了識(shí)讀序列的數(shù)量和準(zhǔn)確性。其次是32P衰變會(huì)導(dǎo)致DNA樣品分解，通常都應(yīng)在測(cè)序反應(yīng)后24h內(nèi)進(jìn)行電泳，否則無(wú)法獲得好的結(jié)果。近年來(lái)α-35S-dNTP被廣泛采用，是由于35S產(chǎn)生較弱的β射線，克服了32P的二大缺點(diǎn)。放射自顯影圖譜具有較高的分辨率和較低的本底，測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降。（五）dNTP類似物二重對(duì)稱的DNA區(qū)段（特別是GC含量高者）可以形成鏈內(nèi)二級(jí)過(guò)程中不能充分變性。因此將引起不規(guī)則遷移，使鄰近的DNA條帶壓縮在一起，以致難以讀出序列。這種壓縮現(xiàn)象歸因于DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在，而且不可能通過(guò)改變測(cè)序反應(yīng)中出序列。這種壓縮現(xiàn)象歸因于DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)地存在，而且不可能通過(guò)改變測(cè)序反應(yīng)中所用DNA聚合酶的種類而得到減輕。但是凝膠中的壓縮區(qū)段往往可以通過(guò)采用諸如dITP（2'－脫氧次黃苷15'－三磷酸）或7－脫氮－dGTP（7－脫氮－2'－脫氧鳥苷－5'－三磷酸）等核苷酸類似物進(jìn)行分辨。這些類似物與普通堿基的配對(duì)能力較弱，而且是測(cè)序酶和TaqDNA聚合酶等DNA聚合酶的合適底物（Gough和Murray，1983;Mixusawa等，1986;Innis等，1988）。但對(duì)某些壓縮條帶，7－脫氮－dGTP無(wú)濟(jì)于事；同樣，dITP也無(wú)補(bǔ)于另一壓縮條帶（尤其是得于GC豐富區(qū)的縮條帶）的分辨。如果需要采用類似物，首先可試用dOTP，如果壓縮條帶用dITP或7－脫氮－dGTP都無(wú)法分辨，則轉(zhuǎn)而測(cè)定另一條鏈的DNA序列幾乎總能如愿以償。如上所述，兩種形式的測(cè)序酶和TaqDNA聚合酶對(duì)核苷酸類似物的耐受性優(yōu)于大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段。此外，制造廠商聲稱在測(cè)定含穩(wěn)固二結(jié)構(gòu)的模板序列時(shí)，測(cè)序酶2.0版要優(yōu)于原來(lái)的測(cè)序酶。測(cè)序酶2.0版持續(xù)合成能力強(qiáng)于測(cè)序酶，其作用總是一氣呵成，很少半途而廢，因而消除了“鬼”帶。而且，測(cè)序酶2.0版對(duì)諸如dITP類核苷酸類惟物的耐受性看來(lái)也優(yōu)于原來(lái)的測(cè)序酶。（六）關(guān)于DNA序列的識(shí)讀DNA序列的識(shí)讀是一個(gè)熟能生巧的過(guò)程。注意幾點(diǎn)技巧：①在顯影前后一定要注意標(biāo)明模板名稱、日期和測(cè)序人等，并標(biāo)明各套反應(yīng)位置；②識(shí)讀時(shí)從顯而易見的特征序列開始，如連續(xù)的同聚核苷酸（如TTTTT、AAAAA）或交替出現(xiàn)的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT），一旦找到這種序列，便可較快地確定目的序列的位置。三、雙脫氧鏈止終法測(cè)定戰(zhàn)略由于DNA一般都由幾千個(gè)單核苷組成。而目前測(cè)定DNA序列的最好方法，一次也只能測(cè)約600個(gè)核苷酸，因此進(jìn)行DNA順序測(cè)定前，需要用不同限制酶pUC1,18pUCl18,pUC19,M13mp18,M13mp19等載體中，分別測(cè)定各小片段的順序，由于不同限制酶產(chǎn)生的片段之間有交錯(cuò)重疊順序，根據(jù)片段間和末端重疊序列，用計(jì)算機(jī)軟件如MacVectorTM5.0分析DNA，AssemblylignTM排列出各片段的位置，進(jìn)而排出DNA的全序列。四、雙脫氧鏈終止法測(cè)定方法以M13噬菌體為載體的雙氧鏈終止法的實(shí)施步驟為例：1．M13噬菌體復(fù)制型雙鏈DNA（RFDNA）的制備。為了將待測(cè)雙鏈DNA進(jìn)行克隆，必須制備M13mp18或M13mp19復(fù)制型（閉環(huán)雙鏈）DNA，從M9培養(yǎng)基中，挑起單個(gè)克隆大腸桿菌，JM101到50ml2×YT培養(yǎng)基中，37℃振蕩過(guò)夜。稀釋1ml培養(yǎng)物到50ml2×YT培養(yǎng)中，于37℃振搖6h，轉(zhuǎn)移2ml培養(yǎng)物于微量離心管中，12000g，離心5min細(xì)菌沉淀保留用于分離復(fù)制型RFDNA，上清用于分離噬菌體單鏈DNA。細(xì)菌沉淀用于分離復(fù)制型DNA，可以采用標(biāo)準(zhǔn)的堿解方法或采用天美公司的WizardMiniperpsDNA試劑盒制備。（方法同分離質(zhì)粒DNA方法）。2．重組噬菌體制備采用多克隆位點(diǎn)上的限制性內(nèi)加酶切割待測(cè)DNA，并采用相同內(nèi)切酶切割M13噬菌體RFDNA（采用Biol101genecleanⅡ試劑盒分別純化內(nèi)切酶切割后的DNA片段），然后將待測(cè)外源DNA片段與M13復(fù)制型載體DNA連接過(guò)夜，連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)染JM101感受態(tài)細(xì)菌，將連接物10μl與200μl感受態(tài)細(xì)菌混勻，放置冰上40～50min，再放在42℃水浴2min，然后加入1ml新鮮的靜止相JM101培養(yǎng)物混勻，然后分別以300μl于含有IPIG（200mg/ml）和X-gal200mg/ml的2×YT培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)8h即可出現(xiàn)藍(lán)色和白色噬斑，白色或稱無(wú)菌噬斑，即為陽(yáng)性重組噬菌體。3．單鏈?zhǔn)删wDNA（模板DNA）的制備上述平板的每個(gè)白色噬菌斑是由一種重組M13DNA分子轉(zhuǎn)染細(xì)菌后產(chǎn)生的，如果取一個(gè)白色噬菌斑進(jìn)行培養(yǎng)便可得到一種單鏈形式的DNA。為此，挑取一個(gè)白色噬菌斑轉(zhuǎn)接到一個(gè)新鮮制備的OD600=0.1的大腸桿菌JM101培養(yǎng)物中，于37℃振搖5h左右，12000g離心10min，上清轉(zhuǎn)移到另一新微量離心管中用于分離單鏈DNA，按1ml上清液中加入含20%聚乙二醇PEG-6000的2.5mNaCl200μl沉淀噬菌體，再用飽和酚抽提除去噬菌體蛋白，最后用1/10體積的3mNaAc和乙醇沉淀單鏈DNA，濃度調(diào)至0.1～0.5μg/μl，也可采用天美公司的WizardTMM13DNA純化試劑盒分離純化M13單鏈DNA。4．引物制備可以購(gòu)買通用引物或?qū)嶒?yàn)室合成15bp～26bp長(zhǎng)度的引物，通常以2μg/ml的濃度貯存于-20℃?zhèn)溆谩?．微量滴板進(jìn)行大批量的模板測(cè)序時(shí)，常在密閉的微量離心管中進(jìn)行與引物的退火反應(yīng)，然后在微量滴板中進(jìn)行鏈延伸-鏈終止反應(yīng)。6．變性聚丙烯酰胺凝膠測(cè)序凝膠裝置的大小形狀均不相同，其主要參數(shù)有：①長(zhǎng)度通常為40～50cm；②寬度通常為20cm；③厚度通常為0.3～0.4mm；④橫截面形狀為楔形或錐形，即頂部薄，底部厚，或者是將底部凝膠緩沖液的濃度提高；⑤加樣槽；⑥整塊凝膠上的溫度