太子參總皂苷的含量測定方法研究

沈陽藥科大學(xué)成人高等教育畢業(yè)論文太子參總皂苷的含量測定方法研究學(xué)生姓名：專業(yè)形式層次：學(xué)號（或準(zhǔn)考證號）：指導(dǎo)教師：實習(xí)單位：完成時間：通訊地址：郵政編碼：聯(lián)系電話（手機(jī)）：本人鄭重聲明：所呈交的畢業(yè)論文，是本人在指導(dǎo)老師的指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果，成果不存在知識產(chǎn)權(quán)爭議，除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。畢業(yè)論文作者簽名：引言太子參（Princens）,別名又叫孩兒參、童參、雙批七、四葉參或米參，其入藥部分為石竹科植物孩兒參的干燥塊根，在很久之前百姓就把它當(dāng)做滋補(bǔ)的食材和藥材。根據(jù)我國傳統(tǒng)中醫(yī)書籍記載，太子參味甘，微苦，性平，歸經(jīng)脾，肺，具有類似人參益氣健脾、生津潤肺的功效。雖然藥效不強(qiáng)，但不失為清補(bǔ)良品，主治脾胃虛弱、食欲不振、自汗氣短、心悸失眠、病后虛弱、肺燥干咳等。人參和西洋參、太子參作為藥用和食用健康營養(yǎng)的飲食習(xí)慣在我國部分地區(qū)（如閩東）從古代一直延續(xù)到現(xiàn)在。太子參主要化學(xué)成分含有太子參皂苷、棕櫚酸、亞油酸、谷甾醇等，還含有糖、磷脂、氨基酸、揮發(fā)油及微量元素錳、鐵、銅、鋅等.近幾年，越來越多的人發(fā)現(xiàn)太子參的作用，相應(yīng)的保健產(chǎn)品也越來越多，如復(fù)方太子參口服液、太子參膠囊、太子參止咳平喘精（散）、太子寶、真空膨化太子參系列產(chǎn)品，甚至將提取太子參的液體加入到化妝品中。以往對太子參活性成分的研究多集中于多糖類物質(zhì)，其生理活性研究基本為零?，F(xiàn)有關(guān)研究證實，太子參的活性藥效成分——太子參皂苷，對于調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、抗氧化、抗自由基、抗疲勞，鎮(zhèn)咳及抗菌抗病毒具有一定功效，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。為了進(jìn)一步研究太子參皂苷的生理活性，開發(fā)太子參，太子參總皂苷的測定方法的簡便快速、準(zhǔn)確、可靠具有關(guān)鍵意義。第1章材料與方法1.1材料1.1.1試藥太子參藥材粉末1.1.2儀器與試劑FA2004型分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；恒溫水域鍋（金壇市大地自動化儀器廠）；SHZ-95B型循環(huán)水壓式多用真空泵（上海予正儀器設(shè)備有限公司）；SG8200HPT超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；SZ-93A自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；GZX-9146MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；722S可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）。人參皂苷Rb1（中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇（AR,重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；濃硫酸（AR,重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；香草醛（AR,天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；高氯酸（AR,成都金山化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（AR,天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（AR,重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；正丁醇（AR,成都金山化學(xué)試劑有限公司）；雙蒸水（自制）。1.2方法表2顯色系統(tǒng)考察結(jié)果Tab.2Resultsofcolorconditionsinspection測試液顯色系統(tǒng)初始60min改變率編號吸光度吸光度（%）①0.0320.0332.15太子參②0.1560.1602.55供試液③0.1960.21710.73④0.1730.15113.06⑤0.1580.13812.46①0.0510.0536.68人參皂苷②0.3100.3051.61對照液③0.3450.3323.56④0.2550.2299.94⑤0.2470.2277.931.2.1供試液制備單因素根據(jù)文獻(xiàn)中的方法，運(yùn)用超聲波半微量提取快速測定法H來測定人參皂苷，在具塞錐形瓶中加入過藥典5號篩的太子參藥材粉末0.1g，同時注入溶劑25mL，40min超聲（功率500W,頻率50Hz）后抽濾，取續(xù)濾液5mL到蒸發(fā)皿中，進(jìn)行水浴蒸干，用甲醇溶解于10mL容量瓶中，供試液制作完成。在10mL具塞試管中加入2mL的供養(yǎng)液，沸水浴揮去溶劑，并加入0.2mL5%的香草醛-冰醋酸溶液（需臨時配制）與0.8mL高氯酸混勻，密塞，置60°C水浴中加熱20min，用冷水冷卻后，加入冰醋酸5mL搖勻。另取相同體積甲醇設(shè)定為空白對照，在560nm波長下測定吸光度。（1） 提取溶劑的選取。挑選甲醇、無水乙醇、水飽和的正丁醇三種液體為提取溶劑來制備太子參供試液，所測定的總皂苷含量分別為2.72%、0.66%和14%。由于不同的提取溶劑制備的供試液中存在的雜質(zhì)不同，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道，太子參中所含的皂苷總量不超過1.0%H，所以無水乙醇作為溶劑制得的皂苷供試液中雜質(zhì)最少，本實驗用無水乙醇為提取溶劑最佳。（2） 料液比的選取。稱0.1g藥典5號篩的太子參藥材粉末到具塞錐形瓶中，分別加入無水乙醇溶液10、15、20、25mL，超聲提取總皂苷含量分別為0.62%、0.73%、0.71%、0.66%。測試結(jié)果表明皂苷含量與加入的溶劑量非正比例關(guān)系，溶劑量達(dá)到一定值后，皂苷含量反而減少。0.1g藥材與15mL無水乙醇混勻所制得的供試液中總皂苷含量最高，所以本實驗以15mL無水乙醇制備供試液為最佳。（3） 藥材粒度的篩選。稱取0.1g的過藥典3、5、6、7、8號樣品藥材于五個不同容器中,同時加入15mL相同的無水乙醇溶液，超聲提取后測定總皂苷含量分別為0.48%、0.73%、0.74%、0.75%、0.74%。過藥典8號篩與過藥典6號篩所測定的結(jié)果相同，而過藥典7號篩時所測得的皂苷含量最高，這可能因為過藥典8號的藥材粒度過小，少量藥渣堵塞濾紙，導(dǎo)致結(jié)果偏低。所以本實驗用過藥典7號篩的藥粉進(jìn)行測定為最佳。（4） 提取時間的選取。稱取相同藥材粉末0.1g（最佳為過藥典7號篩）加入15mL無水乙醇后，分別超聲提取20、30、40、60、90、120、150min,測定總皂苷含量分別為0.45%、0.65%、0.75%、0.76%、.78%、.79%、0.73%。從實驗結(jié)果可以看出，在120min時皂苷含量測定值最高。在120min前皂苷含量與提取時間成正比。在150min時，皂苷含量明顯降低，可能是由于時間過長后，溶劑升溫，部分待測成分結(jié)構(gòu)因為溫度而改變，使結(jié)果大幅度降低了。在90min與120min時皂苷含量相差不大，考慮到成本、工作效率等因素，本實驗選提取90min來測定為最佳。1.2.2供試液制備稱0.1g太子參藥材粉末（過藥典7號篩）于容器，加15mL無水乙醇溶解,超聲提取90min,過濾取續(xù)濾液5mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，在甲醇中溶解并定容于10mL容量瓶中，作為備用的供試液。1.2.3供試液顯色系統(tǒng)選取由于太子參總皂苷測定中沒有從太子參中分離得到的對照物，所以，選取化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的人參皂苷Rb1作為對照來考察了供試液顯色系統(tǒng)。取2mL太子參供試液到具塞試管中，水浴揮干后，于560nm處分別按下列顯色系統(tǒng)進(jìn)行吸光度的測定；同時稱10.76mg人參皂苷Rb1用甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，混合均勻后取0.2mL于具塞試管中，水浴揮干后也分別按下列顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色反應(yīng)：（1）加入5mL高氯酸,放置在25°C水浴中保溫20min,取出后冷卻至室溫后進(jìn)行測定0。（2）加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液，混勻后，加入5mL60%硫酸溶液,混合均勻后放置在60C水浴中保溫20min,取出后馬上用冷水冷卻后測定6。（3）加入0.2mL8%香草醛-乙醇溶液，混勻后，加入5mL60%硫酸溶液，再次混合均勻，放置在60C水浴中保溫20min,取出后馬上用冷水冷卻后測定63。（4）加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液，混勻后，加入0.8mL高氯酸，再次混合均勻，放置在60C水浴中保溫20min，取出后馬上用冷水冷卻，再加入冰醋酸溶液5mL，搖勻后進(jìn)行測定67。（5）稱0.1g香草醛放置于10mL的容量瓶中，依次加入冰醋酸2mL和高氯酸8mL，配置成5%的香草醛-冰醋酸和高氯酸以1：4比例混合的混合液。取1mL混合液于具塞試管中搖勻，放置在60C水浴中保溫20min,取出后用冷水冷卻，再加入冰醋酸溶液5mL，搖勻后進(jìn)行吸光度的測定68。每種顯色系統(tǒng)分別用太子參皂苷供試液和人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)液（0.45mg/mL,每次0.2mL參與反應(yīng)）同步測定初始吸光度（、_）和60min時的吸光度（A60_），并計算吸光度的改變率。全面考慮顯色系統(tǒng)的敏感性和穩(wěn)定性，選取最佳顯色系統(tǒng)。1.2.4供試液制備正交設(shè)計優(yōu)化通過單個因素分別考察試驗可以發(fā)現(xiàn)，一旦提取溶劑確定后，對總皂苷含量影響較大一般是藥材粒度、料液比和提取時間，所以，圍繞這3個影響因素設(shè)計了L9（34）3因素3水平的正交試驗（表1）。

表1正交試驗方案Tab.1Thefactorsandlevelsoforthogonaltest因子水平藥材粒度A溶劑用量B（mL）提取時間C（min）1過6號篩10902過7號篩151053過8號篩201201.2.5方法學(xué)考察（1） 線性關(guān)系考察。制備對照品溶液：稱取4.5mg人參皂苷R^對照品,放在25mL容量瓶中，用甲醇溶解，搖勻定容，制作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL的對照品溶液,分別放在10mL相同的具塞試管中，水浴揮干后，加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液,搖勻，再加入5mL60%硫酸溶液,混合均勻后放在60C水浴中保溫20min,取出后用冷水冷卻進(jìn)行吸光度的測定。同時用甲醇作為空白對照，在560nm波長處進(jìn)行測定，把結(jié)果整理繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)為人參皂苷Rb1對照品溶液濃度（pg/mL），縱坐標(biāo)為測得的吸光度。（2） 精密度試驗。按照1.2制備皂苷供試液，吸取2mL供試液,按上述線性關(guān)系進(jìn)行測定，從“水浴下?lián)]干溶劑”開始測定吸光度，計算RSD值。（3） 穩(wěn)定性試驗。按1.2制備皂苷供試液，吸取2mL供試液,按上述線性關(guān)系進(jìn)行測定，從“水浴下?lián)]干溶劑”開始，每隔20min測定1次吸光度，計算RSD值。（4） 重復(fù)性試驗。按1.2同時稱取6份太子參藥材，制備出太子參皂苷供試液，吸取2mL供試液,按上述線性關(guān)系進(jìn)行測定，從“水浴下?lián)]干溶劑”開始，測定吸光度并計算RSD值。（5） 加樣回收率試驗。稱0.05g已知總皂苷含量的樣品粉末（過7號篩），同時稱取5份，分別加入相同質(zhì)量的人參皂苷Rbi標(biāo)準(zhǔn)品0.4mg。按1.2制備皂苷供試液的方法，取2mL供試液,按上述線性關(guān)系進(jìn)行測定，從“水浴下?lián)]干溶劑”開始，測定吸光度，計算平均回收率以及RSD值。第2章結(jié)果與分析2.1顯色系統(tǒng)篩選由于太子參總皂苷的含量不是自己本身的含量，而是用人參皂苷R^標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定的，所以人參皂苷R^和太子參皂苷供試液在顯色系統(tǒng)中的敏感性及穩(wěn)定性決定著選取的顯色系統(tǒng)好壞。由試驗結(jié)果可以看出（表2），顯色系統(tǒng)②的敏感性與穩(wěn)定性都相對最高，所以，用②號顯色系統(tǒng)來測定最佳。具體為：向存在已揮干溶劑的供試液的具塞試管中加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液,搖勻，加入5mL60%硫酸溶液,混合均勻后放在60°C水浴中保溫20min,取出后用冷水冷卻，在光密度560nm處進(jìn)行測定。2.2精密度試驗按上述太子參皂苷供試液制備的方法，制備出太子參供試液，連續(xù)快速地測定5次，吸光度分別為0.155、.152、.156、.154、.154，計算得到RSD值為0.96%，表明儀器精密度良好。根據(jù)1.2項下太子參皂苷供試液制備的方法，2.3.3穩(wěn)定性試驗制備太子參供試液，分別測定0、20、40、60、80、100min時的吸光度，分別為0.155、0.152、.154、.156、.154、.155，計算得到RSD值為0.88%，表明該測定方法在100min內(nèi)是穩(wěn)定。根據(jù)1.2項下太子參皂苷供試液制備的方法，2.3.4重復(fù)性試驗平行稱取6份同批次太子參藥材制備太子參供試液，測定皂苷含量。計算得到RSD值為1.97%（表4），表明該方法重復(fù)性良好。按1.2項下太子參皂苷供試液制備的方法，2.3.5加樣回收率試驗平行稱取5份已知皂苷含量的同產(chǎn)地太子參藥材，分別加入0.4mg人參皂苷制備太子參供試液，測定皂苷含量。計算RSD值為1.25%，平均回收率為98.82%（表5），表明該方法準(zhǔn)確度良好。第3章討論3.1太子參皂苷不僅具有增強(qiáng)免疫力等藥理作用，其含量還在一定程度上表征太子參生長的環(huán)境變化，因此，在太子參的質(zhì)量控制中，太子參的皂苷含量舉足輕重。目前，由于太子參皂苷在測定中缺少自身標(biāo)準(zhǔn)品，所測得的含量多為一種模糊值，使保證太子參的質(zhì)量受限。本試驗得到的超聲波半微量提取測定法，較其他方法具有快捷、靈敏、取樣少等優(yōu)點，在太子參中皂苷標(biāo)準(zhǔn)品缺少的測定研究中，具有一定的應(yīng)用價值。但若想使太子參皂苷作為一個指標(biāo)性成分在太子參的質(zhì)量控制中得到更好的應(yīng)用，還需要在太子參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品方面深入研究。3.2超聲波是一種機(jī)械波，散射衰減發(fā)生在不均勻介質(zhì)中傳遞時，實驗中超聲提取時，樣品整體作為一種介質(zhì)在各方向上是不均勻的，到達(dá)樣品內(nèi)部的超聲機(jī)械能量會有一定程度的衰減，從而影響提取效果H。本試驗采用〇.1g的藥材用量，其原因：一是可以使藥材不受震動、搖晃等影響，在250mL的具塞錐形瓶中都能平鋪于瓶底，堆積厚度較小，降低了超聲波的衰減；二是使試劑更充分的浸提樣品內(nèi)部的作用；三是當(dāng)使用較少藥材時一定程度可忽略雜質(zhì)干擾。結(jié)論在當(dāng)今的社會，新的生物皂苷資源存在舉足輕重的意義，為工業(yè)化生產(chǎn)太子參皂苷、開發(fā)相關(guān)保健食品和進(jìn)一步在醫(yī)學(xué)臨床試驗中的應(yīng)用提供科學(xué)根據(jù)。至今為止，太子參總皂苷的測定方法很少，一般是在可見光區(qū)中定量測定皂苷與芳香醛高氯酸試劑產(chǎn)生的顯色反應(yīng)。本實驗參考眾多文獻(xiàn)，綜合考慮用不同提取方法，如：用水浸提法、正丁醇萃取法、丙酮-乙醚沉淀法、大孔吸附樹脂法等方法進(jìn)行太子參中的有效成分的定性測定，一旦確定含有三萜皂苷這種化合物后，采用分光光度法，以人參皂苷Re為對照品，測定太子參中總皂苷的含量，方法快速簡單，重復(fù)性良好。參考文獻(xiàn)[1]彭愛紅，熊何健，顏宇航.太子參總皂苷的含量測定方法研究[J].四川師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，06：743-746.[2]竇芳，湯海峰，奚苗苗，文愛東.11種中藥總皂苷對α-葡糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用研究[J].中國藥房，2013，v.24；No.43319：1732-1734.[3]張敏，王慧娟，林冰，趙致，周英.太子參總皂苷含量測定方法研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2013，v.32；No.13405：432-436.[4]林茂，鄭炯，楊琳，陳婭婭，王沁，吳明開，朱國勝，闞健全.不同產(chǎn)地太子參中化學(xué)成分分析[J].食品科學(xué)，2012，v.33；No.42302：204-207.[5]丁春花，林培玲，曾建偉，陳丹，梁一池.太子參塊根和參須中多糖及總皂苷含量的測定[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，v.22；No.11503：40-43.[6]梁玉勇，尹雙雙，左北梅，高文遠(yuǎn).太子參不定根組織培養(yǎng)的研究[J].中國中藥雜志，2012，v.3724：3803-3807.[7]趙凱，贏飄，張欣，曹國璠.連作年限對太子參經(jīng)濟(jì)性狀、產(chǎn)量