《藥理實驗方法學：體外實驗方法綜述》2800字

藥理實驗方法學：體外實驗方法綜述體外實驗方法一：Westernblotting（蛋白免疫印跡實驗）一、實驗原理：貼壁細胞總蛋白的提取

蛋白樣品的濃度定量

SDS電泳蛋白由凝膠轉(zhuǎn)到固定相膜上一抗、二抗孵育曝光液浸潤顯影拍照實驗材料：超凈臺、細胞刮棒、96孔板、移液槍、超速離心機、PBS緩沖溶液、裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA定量檢測試劑盒、磷酸酶抑制劑、配膠架、配膠玻璃板、PVDF膜、特定的一抗、二抗，曝光液。二、實驗步驟：

(一)細胞總蛋白的提取倒去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細胞；將培養(yǎng)皿微微傾斜，用細胞用胰酶或者直接刮下來，收集細胞懸液于離心管中，用記號筆做好分組標記；2500rpm離心10min富集細胞于離心管底部；倒棄上層液體，并用鑷子夾取濾紙吸干離心管內(nèi)的水份，倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干殘留的水份；配置裂解液，按照比例加入相應(yīng)的蛋白酶抑制劑。根據(jù)收集的細胞量往各離心管中加入一定體積的裂解液,于冰上裂解30~60min。然后，用移液槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中(冰上操作)。4℃下12000

rpm離心30分鐘。離心結(jié)束后，將蛋白上清分裝標記，放于-20℃冰箱里儲存。

(二)蛋白樣品的初步定量

（1）取BCA定量試劑盒A液和B液，按1：50配置成工作液；（2）往96孔板每孔中加入200ul的BCA工作液和19ul的生理鹽水和1ul的蛋白上清液，立即將96孔板放入37℃的烘箱里面孵育30min.。（3）打開酶標儀，調(diào)整好參數(shù)過后，將96孔板放入酶標儀進樣架上，點擊開始檢測，記錄讀數(shù)。（4）用EXCEL處理好數(shù)據(jù)，加入對應(yīng)量的裂解液和上樣緩沖液配平各組的蛋白，然后在加熱器上煮蛋白5min使之變性。

(三)

SDS電泳

仔細地檢查玻璃板是否完整有無缺口，然后清洗玻板，避免有任何雜質(zhì)的存在；將玻板對齊裝入配膠架中然后放入配膠架上；按照試劑盒上的指南配好膠，用移液槍將膠液緩慢加入玻板夾縫中并預(yù)留一定的高度配制上層，然后加入異丙醇壓膠，室溫放置使凝固（避免氣泡的產(chǎn)生）；等分離膠凝固后，倒去上層的異丙醇，直接加入上層膠，立即將梳子插入濃縮膠中。當上層膠凝固后,兩手分別

抓住梳子的兩邊輕輕地向上將其拔出；將配好的膠板放入電泳槽中，加入電泳液并組裝好電泳設(shè)備；根據(jù)實驗情況往各孔中加入marker或者制備好的蛋白樣品10ul~15ul；調(diào)節(jié)電泳參數(shù)，電泳時間一般1h~2h,電壓為100

v。（四）轉(zhuǎn)膜

（1）配置足量的轉(zhuǎn)移液,另外準備200毫升的甲醇用于平衡凝膠和膜以及濾紙；（2）打開玻璃板，取出凝膠,切除多余的膠；（3）裁剪好膜，然后將膜放入甲醇中浸潤激活1min；（4）依次將?？s墊、濾紙凝膠、膜按照順序疊放好用玻璃棒去除其中的氣泡；（5）組裝好轉(zhuǎn)膜設(shè)備調(diào)整參數(shù)，打開電源，一般電流為200

mA，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)目標蛋白的分子量來定；

（6）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用記號筆標注,以判斷蛋白的位置和種類。（五)免疫反應(yīng)

(1)將膜放入TPBS中清洗一段時間后,轉(zhuǎn)移至含有封閉液的培養(yǎng)皿中封閉30min;

(2)將一抗用稀釋液稀釋后放入相應(yīng)的容器中，將膜用TPBS清洗兩到三遍后放入對應(yīng)的抗體中4℃孵育過夜；

(3)稀釋配置二抗,將孵育好一抗的膜放入二抗中孵育，然后用TBST在室溫下脫色端床上洗3次,每次5分鐘:；(六)曝光顯影（1)將A和B兩種試劑在培養(yǎng)皿中等體積混勻，然后將膜浸入曝光液中1~2分鐘后放在玻板中，放入曝光儀準備曝光；(2)點擊曝光機軟件中的開始曝光，開始計時:根據(jù)信號的強弱適當調(diào)整曝光時間,選擇不同時間觀察曝光效果,以達最佳效果。Westernblotting實驗操作步驟較多，核心環(huán)節(jié)很關(guān)鍵，例如細胞的藥物處理是否合理將直接影響最終的實驗結(jié)果，提蛋白時是否加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑將決定目標蛋白的檢測結(jié)果是否有意義。此外配膠也是重要的環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到后續(xù)的實驗是否能夠進行。電泳電壓，時間也很關(guān)鍵，關(guān)系到是否能夠有效的分離目標蛋白。除此之外，轉(zhuǎn)膜的方式，參數(shù)配置和時間都影響目標蛋白的檢測。一抗、二抗的質(zhì)量和孵育方式、時間也會對實驗的結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，本實驗的成敗關(guān)鍵在于細心，操作細膩有條不紊才能獲得理想的結(jié)果。

體外實驗方法二：cck-8實驗原理：cck-8是一種還原性的物質(zhì)，細胞的線粒體內(nèi)的琥珀酸復合體能夠?qū)⑵溲趸x成橙黃色的物質(zhì)，根據(jù)吸光度的大小可以計算出出細胞的相對活性變化。實驗材料：96孔板，培養(yǎng)基，CCK-8試劑盒、酶標儀。實驗步驟：（1）消化稀釋細胞，制成懸液，計數(shù)計算，加入有一定體積的培養(yǎng)基稀釋重懸；（2）一般用96孔板進行實驗，設(shè)置一個空白對照，其他為實驗組，每組可設(shè)置5~6個復孔。依次往每孔中加100ul中稀釋好的細胞懸液。（3）種板過夜后，細胞生長密度適中時，吸出各孔培養(yǎng)基?？瞻捉M加不含藥培養(yǎng)基，實驗組加入含藥物培養(yǎng)基。藥物處理一段時間后，再次吸出各孔培養(yǎng)基。往各孔加入CCK-8占總體積10%的培養(yǎng)基.，放入烘箱中孵育一段時間后（時間根據(jù)預(yù)實驗判斷）將96孔板取出，放入酶標儀檢測（波長設(shè)為450nm），記錄讀數(shù)進行細胞存活率和IC50計算體內(nèi)實驗方法一：小鼠皮下瘤的接種實驗原理：基質(zhì)膠配置細胞懸液用注射器注入小鼠頸部皮下成瘤后每天觀察瘤的變化，測量瘤的長寬高，計算瘤的體積，對小鼠進行稱重當瘤體積達到閾值時進行隨機分組給藥每天測量小鼠瘤的體積和體重實驗結(jié)束后處死小鼠，取出腫瘤進行HE染色、免疫組化染色比較各組之間的差異實驗材料：超凈臺、注射器、戊巴比妥鈉、滅菌手術(shù)剪、酒精棉簽、電子天平、基質(zhì)膠、標尺實驗步驟：細胞預(yù)處理：實驗用到的細胞是HHCC827細胞，用胰酶消化下，加入培養(yǎng)基混懸后離心富集，然后按PBS和基質(zhì)膠1:2的比例進行重懸配置成接瘤體系（細胞懸液的濃度為1X108個/ml）。麻醉：腹腔注射戊巴比妥鈉（按7mg/Kg）用注射器吸取一定體積的接瘤體系，按每只裸鼠0.2ml進行接瘤。先用針頭挑起小鼠的皮膚，沿著頸部平行緩慢進針，深度為3~4mm,緩慢注射入細胞懸液，然后緩緩退出針頭。本實驗的成敗關(guān)鍵點是細胞懸液的制備，細胞的狀態(tài)和濃度是非常重要的，細胞數(shù)太少無法成瘤，太多會導致裸鼠的死亡，此外注射的位置也很重要，通常位于裸鼠的頸部，若注射部位不合理，裸鼠可能會抓、咬接瘤部位，造成實驗的失敗。體外實驗二：大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的建立實驗原理：碘乙酸（Iodoaceticacid）注射入大鼠的骨關(guān)節(jié)出，誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎癥注射0.2ml碘乙酸到大鼠關(guān)節(jié)腔，對照組注射生理鹽水作為參照每天觀察測量拍照記錄關(guān)節(jié)處的顏色形態(tài)體積的變化情況，當關(guān)節(jié)處發(fā)生明顯的變化后，檢測大鼠關(guān)節(jié)的痛域分離剝出關(guān)節(jié)滑膜，進行拍照、HE染色、免疫組化分析實驗材料:6~8周的SPF級SD大鼠，雄性，體重為150g~180g之間。實驗步驟：將SD大鼠進行隨機分組。模型組和藥物組大鼠，注射0.2ml碘乙酸到大鼠關(guān)節(jié)腔，往對照組大鼠的關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水作為參照。每天對SD大鼠的關(guān)節(jié)處進行測量觀察，拍照記錄關(guān)節(jié)處的顏色形態(tài)體積的變化情況，記稱重記錄體重；將