畢赤酵母發(fā)酵手冊(cè)

畢赤酵母發(fā)酵手冊(cè)

畢赤酵母發(fā)酵手冊(cè)總覽簡(jiǎn)介：畢赤酵母和釀酒酵母非常相似，都非常適合發(fā)酵生長(zhǎng)。畢赤酵母在可能提高總體蛋白質(zhì)產(chǎn)量的發(fā)酵中能夠達(dá)到非常高的細(xì)胞濃度。我們建議只有那些有過(guò)發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)或能得到有經(jīng)驗(yàn)的人的指導(dǎo)的人參與發(fā)酵。因?yàn)榘l(fā)酵的類型很多，所以我們很難為您的個(gè)人案例提供詳細(xì)的過(guò)程。下面所給出的指導(dǎo)是基于Mut+和Muts兩種基因型的畢赤酵母菌株在15L的臺(tái)式玻璃發(fā)酵罐中發(fā)酵而成。請(qǐng)?jiān)谀陌l(fā)酵開(kāi)始前先閱讀操作員手冊(cè)。下面所給出的表是整個(gè)指導(dǎo)的概況。步驟標(biāo)題頁(yè)碼1發(fā)酵參數(shù)12設(shè)備推薦和培養(yǎng)基的制備23培養(yǎng)中溶氧的測(cè)量和使用34種子液的培養(yǎng)45在分批和分批補(bǔ)料培養(yǎng)中生物量對(duì)應(yīng)于4-5甘油的生成6Mut+和Muts基因型重組子在甲醇分批補(bǔ)料狀態(tài)下表達(dá)的介紹6-77細(xì)胞的成熟與衰退88參考文獻(xiàn)9-109配方11發(fā)酵參數(shù)：在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中監(jiān)測(cè)和調(diào)控下列參數(shù)非常重要。下面的表格描述了這些參數(shù)和監(jiān)測(cè)這些參數(shù)的原因。參數(shù)原因溫度（30℃）在32℃以上的溫度下生長(zhǎng)不利于蛋白質(zhì)的表達(dá)溶氧（＞20％）畢赤酵母利用甘油和甲醇需要氧氣pH（5.0-6.0和3.0）對(duì)于外源蛋白分泌到培養(yǎng)基中和最適生長(zhǎng)非常重要轉(zhuǎn)度（500-1500rpm）通氣（玻璃發(fā)酵罐中為0.1-1.0vvm※）使培養(yǎng)基中的氧濃度達(dá)到最大值消泡劑（消除泡沫的最小量）碳源（變化率）每分鐘1體積發(fā)酵液（L）中氧氣的體積（L）使培養(yǎng)基中的氧濃度達(dá)到最大值取決于設(shè)備推薦：下面是所推薦設(shè)備的清單：發(fā)酵罐的夾套需要在發(fā)酵過(guò)程中給酵母菌降溫，尤其是在甲醇流加過(guò)程中。你需要一個(gè)固定的來(lái)源來(lái)提供冷卻水（5-10℃）。這可能意味著你需要一個(gè)冷凍裝置來(lái)保持水的冷卻。一個(gè)泡沫探針就像消泡劑一樣不可或缺。一個(gè)氧氣的來(lái)源——空氣（不銹鋼的發(fā)酵罐需要1-2vvm）或者純氧（玻璃發(fā)酵罐需要0.1-0.3vvm）。添加甘油和甲醇的補(bǔ)料泵。pH的自動(dòng)控制。培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：你需要準(zhǔn)確配置下列溶液：發(fā)酵所需的基本鹽類（第11頁(yè)）PTM1補(bǔ)充鹽類（第11頁(yè)）75ml的50％的甘油每升初始發(fā)酵液，12ml的PTM1補(bǔ)充鹽每升甘油。本文介紹了在畢赤酵母生長(zhǎng)過(guò)程中維持溶氧濃度的重要性以及如何進(jìn)行測(cè)量和調(diào)控。首先，使用100％甲醇發(fā)酵液時(shí)，每升甲醇需添加12ml的PTM補(bǔ)充鹽。畢赤酵母的生長(zhǎng)可以通過(guò)測(cè)量OD600的吸光值和濕細(xì)胞的重量來(lái)檢測(cè)，并且代謝速率可以通過(guò)觀察溶氧濃度來(lái)測(cè)定。維持適當(dāng)?shù)娜苎鯘舛龋ǎ?0％）對(duì)于畢赤酵母在甲醇上的生長(zhǎng)至關(guān)重要。在玻璃發(fā)酵罐中，通氣一般約為0.1-0.3vvm，而在不銹鋼發(fā)酵罐中，壓力可增加OTR。如果發(fā)酵罐不能提供足夠水平的氧氣，甲醇的添加需要適當(dāng)降低。為了使蛋白質(zhì)表達(dá)水平達(dá)到最大，發(fā)酵時(shí)間應(yīng)被分割來(lái)以較低的流加速度添加相似水平的甲醇。DO濃度可用來(lái)衡量代謝速率和碳源是否受抑制，代謝速率則是培養(yǎng)健康程度的一個(gè)指標(biāo)。最后，過(guò)多的甲醇可能會(huì)產(chǎn)生毒害，因此需要進(jìn)行調(diào)控。補(bǔ)料前的兩倍左右。3、在補(bǔ)料過(guò)程中，需要監(jiān)測(cè)DO值和pH值。如果DO值下降到20％以下，需要添加適量的氧氣，以確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。4、在甘油補(bǔ)料完成后，需要進(jìn)行一段時(shí)間的培養(yǎng)，以確保細(xì)胞達(dá)到最大生長(zhǎng)狀態(tài)。此時(shí)，可以進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，以產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)。注意事項(xiàng)：在進(jìn)行發(fā)酵前，需要準(zhǔn)備好所有需要的培養(yǎng)基、試劑和設(shè)備，并進(jìn)行滅菌處理。同時(shí)，需要注意培養(yǎng)條件的控制，如溫度、通氣速率、pH值等。在進(jìn)行補(bǔ)料和甲醇誘導(dǎo)時(shí)，也需要嚴(yán)格控制條件，以確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)。速率是非常重要的，以避免細(xì)胞死亡。同時(shí)，注意控制培養(yǎng)液的溫度，以避免過(guò)度發(fā)熱。5、在達(dá)到最優(yōu)的甲醇流加速率后，繼續(xù)培養(yǎng)直到目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平達(dá)到最大值。注意，甲醇的濃度不應(yīng)超過(guò)1％，否則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用?？傊诟视脱a(bǔ)料培養(yǎng)和甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)中，控制細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和代謝活動(dòng)是非常重要的，以達(dá)到最優(yōu)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。同時(shí)，注意控制補(bǔ)料的濃度和速率，以避免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。在發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)胞的成熟和衰退是一個(gè)重要的因素。在發(fā)酵初期，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率很快，但隨著時(shí)間的推移，生長(zhǎng)速率會(huì)逐漸減緩。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到最大密度時(shí)，它們會(huì)進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期，在這個(gè)階段，細(xì)胞數(shù)量保持穩(wěn)定。然而，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞開(kāi)始衰退，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。收獲細(xì)胞和上清液：收獲細(xì)胞和上清液的方法和設(shè)備取決于細(xì)胞總量和上清液的體積。在小型發(fā)酵罐中，可以將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管中，再通過(guò)離心將細(xì)胞和上清液分離。在大型發(fā)酵罐中，可以使用膜過(guò)濾單元或Sharples離心機(jī)分離細(xì)胞和上清液。選擇合適的方法取決于你需要細(xì)胞還是上清液作為蛋白質(zhì)來(lái)源以及你的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。Muts型___酵母菌株的發(fā)酵：Muts型畢赤酵母菌株的氧氣消耗較低，因此不能使用DO值來(lái)估量培養(yǎng)。在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵中，需要調(diào)整甲醇流加速率來(lái)保持甲醇濃度不超過(guò)0.3%。通過(guò)氣象色譜分析可以確定甲醇濃度。在Muts型菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)中，氣象色譜分析是非常有幫助的。甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)：在甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)中，細(xì)胞濃度最終會(huì)增加到350-450g/L濕細(xì)胞。由于大多數(shù)發(fā)酵都采用補(bǔ)料培養(yǎng)模式，因此最終的發(fā)酵體積可能會(huì)接近于2倍初始發(fā)酵體積。甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)一共加入接近740ml每升發(fā)酵液初始體積，持續(xù)約70h。不同蛋白質(zhì)可能會(huì)有所不同。在甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)中，需要按照特定的流加速率添加甲醇，以達(dá)到最佳的產(chǎn)量和質(zhì)量。建議使用玻璃粉進(jìn)行細(xì)胞破碎，但對(duì)于大量的細(xì)胞來(lái)說(shuō)可能會(huì)顯得繁瑣。在這種情況下，我們發(fā)現(xiàn)乳化技術(shù)效果更好。相比于玻璃粉或如花技術(shù)，F(xiàn)rench式細(xì)胞壓碎的效果看起來(lái)不太好。BMGY基本培養(yǎng)基的制備方法如下：將以下成分混合加入1L水中：85％磷酸26.7ml、CaSO40.93g、K2SO418.2g、MgSO414.9g、KOH4.13g、甘油40g。將水加至1L，最后加入（NH4）2SO410g/L。PTM1基本鹽類的制備方法如下