15.體內(nèi)彗星試驗_第1頁
15.體內(nèi)彗星試驗_第2頁
15.體內(nèi)彗星試驗_第3頁
15.體內(nèi)彗星試驗_第4頁
15.體內(nèi)彗星試驗_第5頁
已閱讀5頁,還剩3頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

附件15體內(nèi)彗星試驗InVivoMammalianAlkalineCometAssay1范圍本規(guī)范確定了體內(nèi)彗星試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料的遺傳毒性檢測。2試驗?zāi)康脑u價化妝品用原料的遺傳毒性。3定義堿性單細(xì)胞凝膠電泳:在單個細(xì)胞或細(xì)胞核水平檢測DNA損傷的一種敏感技術(shù)。彗星:經(jīng)過電泳后細(xì)胞核的形狀,形似彗星。細(xì)胞核部分形成彗星頭部,在電場力的作用下脫離細(xì)胞核的DNA片斷形成彗尾?!按题瑺睢奔?xì)胞:顯微圖像下由小或模糊不清的頭以及大的彌漫性尾組成的細(xì)胞。尾部DNA含量:反應(yīng)總強(qiáng)度(彗頭與彗尾之和)中彗星的強(qiáng)度??煞磻?yīng)DNA片斷的數(shù)量,用百分比表示。最大耐受劑量:試驗期內(nèi)引起動物產(chǎn)生輕微毒性效應(yīng)的最高劑量,在這個劑量下,動物產(chǎn)生明顯的臨床體征,如異常行為或反應(yīng),輕微的體重下降或靶組織細(xì)胞毒性,但是并不會引起死亡或痛苦。4試驗原理DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)在強(qiáng)堿性溶液中(pH>13)會松弛,在電場力的作用下,正常的DNA保留在原位不動,而單鏈或雙鏈DNA斷裂所形成的DNA片斷在會向陽極移動,形成彗星狀。DNA片斷所形成的彗星狀拖尾的長度及強(qiáng)度可以反應(yīng)DNA片斷的大小和數(shù)量。通過檢測尾部DNA含量(%)等終點(diǎn)指標(biāo)可以評價DNA損傷程度。5試驗基本原則動物染毒一定時間后處死并解剖動物,獲取靶器官,制備單細(xì)胞懸液。單細(xì)胞懸液與瓊脂糖混合后經(jīng)過裂解過程去除細(xì)胞膜,并暴露于強(qiáng)堿性溶液(pH>13)中進(jìn)行DNA解旋,經(jīng)過電泳、固定、染色,在熒光顯微鏡下觀察,通過分析軟件對彗星狀細(xì)胞進(jìn)行分析,判定DNA損傷程度。每個樣品需分析足夠數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行最終結(jié)果評價。6溶液的配制(所有溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配)低熔點(diǎn)膠以0.5%(w/v)的濃度溶于D-PBS(無Ca2+、Mg?+和酚紅)溶液中,并利用微波爐加熱。配好的膠保存在37℃?45℃,用后棄去。1.0%-1.5%(w/v)基底層標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠常規(guī)熔點(diǎn)瓊脂糖經(jīng)微波爐加熱溶于磷酸鹽緩沖液中(pH7.0?7.4,不含Ca2\Mg?+和酚紅),制成1.0%?1.5%(w/v)標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠。裂解液用純水配制溶液,裂解液終濃度為100mmol/LEDTA-2Na>10mmol/Ltris-base>2.5mol/LNaCL用5mol/LNaOH或6mol/LHC1將溶液pH調(diào)至10,保存于4℃?8℃冰箱中。試驗前,向裂解液中加入1%(v/v)triton-X100和10%(v/v)DMSO,保存于4℃-8℃冰箱至少30mine堿性解旋液和電泳液用純水配制溶液,堿性解旋液和電泳液終濃度為1mmol/LEDTA-2Na和300mmol/LNaOH,pH>13,用前保存于4?8c冰箱中,并測定其pH值。中和液用純水配制溶液,中和液終濃度為0.4mol/Ltris-base(用5mol/LNaOH或6mol/LHC1調(diào)節(jié)pH7.5),保存于4℃?8℃冰箱中。組織勻漿緩沖液將EDTA-2Na溶于HBSS(無Ca?+、Mg2+和酚紅)中,終濃度為20mmol/LEDTA-2Na,用5mol/LNaOH或6mol/LHC1將其pH調(diào)至7.5,保存于4℃?8℃冰箱中,使用前加入10%DMSOo染液DNA熒光染料(如SYBRGold、SYBRGreenLGelred、碘化丙咤或溟化乙錠等),制備和使用按照產(chǎn)品要求。7實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境動物的選擇動物的選擇應(yīng)符合GB14922.1和GB14922.2的有關(guān)規(guī)定,選用SPF級健康成年嚙齒類動物。常用6周齡以上雄性大鼠。實驗開始時,動物體重的差異應(yīng)不超過±20%。動物飼養(yǎng)動物飼養(yǎng)條件應(yīng)符合GB14925、飲用水應(yīng)符合GB5749、飼料應(yīng)符合GB14924的有關(guān)規(guī)定??煞只\群飼(每籠通常不超過5只),也可單籠飼養(yǎng)。室內(nèi)的溫度應(yīng)控制在22℃(±3℃)。相對濕度應(yīng)控制在50%?60%,不低于30%,最高不超過70%(清潔時例外)。照明應(yīng)控制為12h光照、12h黑暗。常規(guī)飲食,自由飲水。動物分組首先應(yīng)確定實驗分組,動物隨機(jī)分配為對照組和試驗組。試驗開始前,實驗動物至少適應(yīng)5天。一般實驗設(shè)計需要三個劑量組以及陰性和陽性對照組,每組動物至少5只。編號應(yīng)使用創(chuàng)傷較小的方法,包括:耳孔法、標(biāo)簽法、烙印法、染色法。8試驗條件溶劑溶劑不應(yīng)該產(chǎn)生毒性作用,并且不應(yīng)當(dāng)與受試物產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。如果使用不常用的溶劑,應(yīng)有數(shù)據(jù)支持該溶劑在受試動物的應(yīng)用、暴露途徑及檢測終點(diǎn)等方面是可行的。應(yīng)根據(jù)受試物的理化性質(zhì)(水溶性或脂溶性)確定受試物所用的溶劑,通常用水、植物油等。應(yīng)當(dāng)注意的是,某些溶劑(特別是粘稠的溶劑)多次使用后,能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及在接觸部位可能增加DNA鏈斷裂的背景水平。樣品的制備固體受試物應(yīng)溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲谢蚧旌显陲嬍郴蝻嬎小R后w受試物可直接或稀釋后染毒。用吸入暴露時,根據(jù)受試物的物理化學(xué)性質(zhì),將其處理為氣體、蒸汽或氣溶膠。受試物應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。對照陽性對照。每次試驗都應(yīng)設(shè)置陽性對照,每種性別至少有3只可供分析的動物。如需進(jìn)行多次采樣(例如,用單一的染毒方案),不僅需要在每一個采樣點(diǎn)設(shè)置陽性對照,而且要確保平行性。陽性對照的暴露途徑可以與受試物不同。陽性對照物質(zhì)應(yīng)該能夠引起靶器官產(chǎn)生DNA鏈斷裂,可以選擇甲磺酸乙酯(EMS)作為陽性對照,其已經(jīng)被證實能夠誘發(fā)多種組織器官產(chǎn)生DNA鏈斷裂效應(yīng)。陽性對照應(yīng)選擇能夠產(chǎn)生中等毒性效應(yīng)的劑量,同時能夠評估試驗的可行性和靈敏度,可以根據(jù)實驗室建立的陽性物劑量-反應(yīng)曲線進(jìn)行選擇。陽性對照組的尾DNA含量(%)應(yīng)該與實驗室前期建立的數(shù)據(jù)范圍保持一致。陽性對照物質(zhì)及其靶器官(作用于嚙齒動物)見表1。也可以選擇其他一些被證實陽性的物質(zhì)。表1陽性對照物及其靶器官化學(xué)物及CAS.號 靶器官甲磺酸乙酯EMS(CAS62-50-0) 所有組織乙基亞硝基胭(CAS759-73-9) 肝、胃、十二指腸、空腸甲磺酸甲酯MMS(CAS66-27-3)肝、胃、十二指腸、空腸、肺及支氣管肺泡細(xì)胞、腎、膀胱、睪丸、骨髓造血系統(tǒng)N?甲基-N-硝基-N-亞硝基胭(CAS 胃、十二指腸、空腸70-25-7)二甲基胱哦咤(CAS306-37-6) 肝、腸甲基亞硝基配(CAS684-93-5)甲基亞硝基配(CAS684-93-5)肝、骨髓、血細(xì)胞、腎、胃、空腸、腦陰性對照。陰性對照組的動物用溶劑單獨(dú)染毒,其余操作過程與試驗組相同,每次試驗每個采樣點(diǎn)每種組織都應(yīng)該設(shè)置陰性對照。陰性對照組的尾DNA含量(%)應(yīng)該在實驗室前期建立的背景數(shù)據(jù)范圍之內(nèi)。必要時增加空白對照。9劑量設(shè)計受試物應(yīng)設(shè)3個劑量組。首先通過預(yù)試驗確定最大耐受劑量,一般取最大耐受劑量及至少兩個適當(dāng)間隔的劑量水平(優(yōu)選劑量間隔為疝)。對于無毒物質(zhì),14天或以上的染毒期,最大染毒劑量采用1000mg/kg/BW/do如果染毒期少于14天,最大染毒劑量采用2000mg/kg/BW/do10染毒方式染毒方式一般選用灌胃方式,除一些陽性物質(zhì)外,一般不建議腹腔注射。灌胃或注射一次染毒的最大體積取決于受試動物的體重,灌胃量不應(yīng)超過1mL/100g體重,水溶液受試物最大染毒量可達(dá)到2mL/100g體重。11采樣時間最佳采樣時間是由受試物或染毒途徑?jīng)Q定的,依據(jù)受試物藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)[在血漿中達(dá)到峰值的時間或組織濃度時,或在多次染毒后的穩(wěn)定狀態(tài)。在沒有動力學(xué)數(shù)據(jù)的情況下,一般在持續(xù)兩次及以上染毒的最后一次染毒后2h?6h采樣,或在單次染毒后的2h?6h和16h?26h均采樣。在最后一個(或一次性)采樣后,在同一時間內(nèi)尸檢所有動物。采樣時間還可以依據(jù)出現(xiàn)在靶器官(如果可用)上的毒作用表現(xiàn)來判斷。12試驗方法12.1組織收集及樣本制備肝臟是最常用來研究并收集數(shù)據(jù)的組織。如果沒有任何背景資料或特定組織,即可選取肝臟。在某些情況下,也可檢查直接接觸部位的臟器(如,經(jīng)口染毒可選取胃)。肝臟及胃的組織收集方法如下。肝臟:(1)取約5mm3肝左葉中間部分,用冷的組織勻漿緩沖液洗去多余的血細(xì)胞;(2)剩下的肝左葉部分用福爾馬林固定用于病理檢查;(3)取下的肝組織用剪刀剪約100次以釋放細(xì)胞;(4)用3mL組織勻漿緩沖液將剪碎的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,輕輕吹打約15次,過篩(孔徑:40|im)得上清液用于制片;田R:(1)將胃沿胃大彎剪開,用冷的PBS清洗胃部;(2)胃分為左右兩部分,分別用于制片和福爾馬林固定病理檢查;(3)用冷的組織勻漿緩沖液清洗用于試驗的胃,棄去前胃部分,腺胃浸于現(xiàn)配冷的組織勻漿緩沖液15min?30min;(4)胃表面上皮用塑料刮板/解剖刀片或Teflon刀片刮幾次后用冷的組織勻漿緩沖液充分沖洗;(5)用不銹鋼壓舌板平的那一面/解剖刀片或Teflon刀片輕輕刮胃粘膜5次或更多以釋放細(xì)胞;(6)用3mL組織勻漿緩沖液將刮下的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,輕輕吹打約15次,過篩(孔徑:40|im)得上清液用于制片;備注:最好將取下的胃展平后固定在硅膠墊板上再進(jìn)行細(xì)胞的刮?。ㄔ搲|板也需冰?。?。制備玻片(1)預(yù)涂載玻片。制片前,載玻片應(yīng)用甲醇浸泡過液以除去表面的油脂,風(fēng)干。預(yù)涂截玻片保證干凈無塵,滴1%凝膠溶液50匹于載玻片上,加上蓋玻片,使瓊脂糖溶液散開,凝固后取下蓋玻片,風(fēng)干30min。(2)制片過程需在單細(xì)胞懸液制備完成lh內(nèi)完成。用冷的組織勻漿緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)至2.0x105個/mL。取上述制備好的各組織單細(xì)胞懸液與0.5%低熔點(diǎn)凝膠1:10混合(應(yīng)確保玻片上的低熔點(diǎn)瓊脂糖的百分比不少于0.45%)。(3)混勻后的單細(xì)胞懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖混合物均勻鋪于第一層凝膠上面,加上蓋玻片,置于4℃冰箱固化5-10min,至凝膠凝固,蓋玻片可慢慢從瓊脂糖上移除。裂解細(xì)胞載玻片在預(yù)冷的裂解液中,于4°C?8c冷藏浸泡中至少lh(或過夜),應(yīng)避免暴露于可能含有紫外線的白光,可以使用黃光或避光。裂解后使用純凈水、中性緩沖液或磷酸鹽緩沖液來沖洗載玻片以去除殘留洗滌劑和鹽份。解旋和電泳載玻片均衡放置在水平電泳槽中,加入足夠的電泳溶液,使得玻片的表面被完全覆蓋(覆蓋深度應(yīng)該始終一致),并盡量減少批次之間的變化。玻片應(yīng)該放置至少20min,等待DNA解旋。在0.7V/cm條件下,電泳時間不少于20min。電泳時間越長(例如30min?40min,可最大限度地提高靈敏度)已知誘變劑的陽性反應(yīng)越強(qiáng)。但是延長電泳時間也可能會導(dǎo)致陰性對照組樣品過度遷移。根據(jù)實驗需求調(diào)整緩沖液的深度以保持電壓穩(wěn)定,以0.7V/cm的速度電泳,電流應(yīng)在保持在300mAo在電泳開始和結(jié)束都需要記錄電流。用于解旋和電泳通常在4℃?10℃避光進(jìn)行,記錄解旋開始時、電泳開始時和電泳結(jié)束后的溫度。電泳后,用預(yù)冷的中和緩沖液漂洗玻片至少5min,在37℃下干燥15min后,室溫或冷藏保存(濕度不高于60%)。12.6染色使用適當(dāng)?shù)腄NA熒光染料(如SYBRGold、SYBRGreenhGelred,碘化丙咤或淡化乙錠等)避光染色5min??稍诩t光或黃光下進(jìn)行,避免受試細(xì)胞受外界其他因素影響,增加結(jié)果的可靠性和真實性。13結(jié)果測定方法使用自動或半自動的圖像分析系統(tǒng)來定量評分彗星。顯微鏡使用恰當(dāng)?shù)姆糯蟊稊?shù)(如200倍)進(jìn)行觀察,顯微鏡上可配備有熒光發(fā)射器和適當(dāng)?shù)臋z測器或數(shù)碼照相機(jī)(如CCD)。分析所有玻片,包括陰性對照和陽性對照,每個樣本(每個動物的每個組織)至少觀察150個細(xì)胞。每劑量至少5只動物,每只動物計數(shù)150個細(xì)胞。在同樣的密度下多觀察幾個視野以確保彗星的尾部沒有重疊。玻片邊緣部分不需要計分。單獨(dú)記錄“刺猬狀'’細(xì)胞的發(fā)生頻率。細(xì)胞在彗星圖像中可分為3類圖譜,即計分細(xì)胞(有清晰的頭部和尾部并與相鄰細(xì)胞沒有干擾)、“刺猬狀”細(xì)胞和不計分細(xì)胞(如彗星頭、彗星尾不清晰或重疊細(xì)胞等),其中只有計分細(xì)胞能夠進(jìn)行尾部DNA百分比的分析,避免偽影。彗星試驗DNA鏈斷裂的觀察終點(diǎn)以尾部DNA含量(也稱尾部強(qiáng)度)作為結(jié)果評價與分析的指標(biāo)。14試驗結(jié)果的評價14.1試驗結(jié)果計算方法:每個樣本(每個動物的每個組織)至少觀察150個細(xì)胞,計算每個細(xì)胞的終點(diǎn)指標(biāo)(尾長、尾矩、尾DNA含量),每個終點(diǎn)指標(biāo)首先計算150個細(xì)胞的平均值,再計算每劑量組5只動物的平均值作為該劑量組該項指標(biāo)的結(jié)果。每個細(xì)胞的終點(diǎn)指標(biāo)=□□二口容劑對照空

4白對照組7=受試組或陽性物終點(diǎn)測定指標(biāo)(尾長、尾矩、尾部DNA含量)口容劑對照組二溶劑對照組終點(diǎn)測定M標(biāo)(尾長、尾矩、尾部DNA含量)平均值方空白對照組=空白對照組終點(diǎn)測定指標(biāo)(尾長、尾矩、尾部DNA含量)平均值試驗滿足以下標(biāo)準(zhǔn),則認(rèn)為試驗成立陰性對照組數(shù)值落在實驗室預(yù)先建立的歷史陰性對照數(shù)據(jù)范圍內(nèi),且陰性對照組尾部DNA含量百分比值應(yīng)V8%;陽性對照組數(shù)值落在實驗室預(yù)先建立的歷史陽性對照數(shù)據(jù)范圍內(nèi),且與陰性對照組數(shù)值相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義;受試物組與平行陰性對照組相比,尾部DNA含量百分比值增加且差異有統(tǒng)計學(xué)意義,并有明顯劑量-反應(yīng)關(guān)系,則判定該受試物體內(nèi)彗星試驗結(jié)果陽性,認(rèn)為在本試驗體系中,該受試物可

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論