液相色譜教程(六)液相色譜定量分析原理

液相色譜教程

(六)

液相色譜定量分析原理Waters中國(guó)培訓(xùn)中心液相色譜定量分析原理在定性的根底上定量,需有純物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)物液相色譜定量是相對(duì)定量的方法:即由量的純標(biāo)樣推算混合物中被測(cè)物的量液相色譜法定量的依據(jù)是:被測(cè)組分的量與響應(yīng)值(峰高或峰面積)成正比由量的標(biāo)樣可求得定量校正因子定量校正因子:是定量計(jì)算公式中的比例常數(shù),其物理意義是單位響應(yīng)值(峰面積)所代表的被測(cè)組分的量測(cè)定未知組分的響應(yīng)值,通過(guò)定量校正因子即可求得其含量液相色譜定量分析的步驟開(kāi)發(fā)一個(gè)適合定量分析的色譜方法:確認(rèn)被檢測(cè)組分峰,并到達(dá)別離度(R)大于1.5確定被測(cè)組分色譜峰的一致性(純度)確定方法的檢測(cè)限及定量限;靈敏度及線性范圍用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品建立校正曲線考查定量方法的準(zhǔn)確度及精密度用相應(yīng)的色譜管理軟件實(shí)施樣品采集,數(shù)據(jù)處理及報(bào)告結(jié)果鑒別需定量的色譜峰(定性)定性鑒別每個(gè)要定量的色譜峰首先用標(biāo)樣確定欲定量之色譜峰的保存時(shí)間(Rt)通過(guò)比較保存時(shí)間,找到未知樣中各色譜峰所對(duì)應(yīng)的組份色譜定性是用與標(biāo)樣比較保存時(shí)間的方法,判據(jù)并不充分因此要明確：保存時(shí)間相同，可能是同樣的組份保存時(shí)間不同，肯定不是同樣的組份用保存時(shí)間定性用“標(biāo)樣〞的保存時(shí)間(Rt)確認(rèn)被測(cè)組份進(jìn)一步確實(shí)認(rèn)(定性)標(biāo)準(zhǔn)參加法同時(shí)用其它方法其它色譜方法(改變機(jī)理,如:用不同的色譜柱)其它檢測(cè)器PDA,光譜圖比較、譜庫(kù)檢索MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫(kù)檢索其它儀器方法標(biāo)準(zhǔn)參加法舉例廢水樣品中五氯苯〔PCP〕的分析梯度曲線梯度曲線PCP4ppm3ppm2ppm1ppm確認(rèn)定量峰的一致性確認(rèn)色譜峰的一致性(純度)保證每個(gè)色譜峰下只有一個(gè)被測(cè)的組份檢查是否有共流出的物質(zhì)〔雜質(zhì)〕干擾色譜峰一致性(純度)確認(rèn)的方法用光電二極管矩陣(PDA)檢測(cè)器比較光譜圖峰純度鑒定,2487雙波長(zhǎng)RatioPlot圖形分析2996的純度角理論HPLC定量分析常用術(shù)語(yǔ)(1)樣品(Sample):含有待測(cè)物,供色譜分析的溶液樣品類型(SampleType)分為標(biāo)樣和未知兩種:標(biāo)樣(Standard):濃度的純品未知樣(Unknow):濃度待測(cè)的混合物樣品重量(SampleWeight):待測(cè)樣品的原始稱樣量稀釋度(Dilution):未知樣品的稀釋倍數(shù)組分(Componance):欲做定量分析的色譜峰,即含量未知的被測(cè)物組分的量(Amount):被測(cè)物質(zhì)的含量(或濃度)HPLC定量分析常用術(shù)語(yǔ)(2)積分(Integrity):由計(jì)算機(jī)對(duì)色譜峰進(jìn)行峰面積測(cè)量的計(jì)算過(guò)程定量限:可以準(zhǔn)確定量的樣品最低量一般要求色譜峰的信噪比(S/N)＞10:1校正曲線(CalibrationCurve):組分含量對(duì)響應(yīng)值的線性曲線,由量的標(biāo)準(zhǔn)物建立,用于測(cè)定待測(cè)物的未知含量常用的定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法,分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法:外標(biāo)法在液相色譜中用得最多內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確，但是麻煩在標(biāo)準(zhǔn)方法中用得最多外標(biāo)法定量(一)配制一系列濃度的標(biāo)樣外標(biāo)法定量(二)采集不同濃度標(biāo)樣的色譜圖積分,按外標(biāo)法定量計(jì)算,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量〔三〕計(jì)算公式特點(diǎn)無(wú)需各組份都被檢出、洗脫需要標(biāo)樣標(biāo)樣及樣品測(cè)定的條件要一致進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確內(nèi)標(biāo)法定量(一)配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)法定量(二)采集不同濃度標(biāo)樣的色譜圖積分,按內(nèi)標(biāo)法定量計(jì)算,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線05010015020025001020304050樣品濃度標(biāo)樣峰面積內(nèi)標(biāo)樣峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量(三)計(jì)算公式：特點(diǎn)：無(wú)需各組份都被檢出、洗脫需要標(biāo)樣，需要內(nèi)標(biāo)樣結(jié)果與進(jìn)樣體積無(wú)關(guān)內(nèi)標(biāo)法定量〔四〕對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測(cè)組分相似(同系物、異構(gòu)體)在樣品中不存在不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反響保存值與待測(cè)組分接近濃度〔響應(yīng)值〕與待測(cè)組分相當(dāng)其色譜峰與其它色譜峰別離好定量分析的數(shù)據(jù)處理方法手工計(jì)算用積分操作計(jì)算峰面積(響應(yīng)值)用含量對(duì)應(yīng)峰面積計(jì)算響應(yīng)因子用未知物的峰面積通過(guò)響應(yīng)因子計(jì)算含量Waters軟件程序計(jì)算Empower包含外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)法計(jì)算的程序處理結(jié)果自動(dòng)存貯至Project的Result中其它軟件計(jì)算例如EXcell液相色譜定量的精密度測(cè)量的精密度精密度的衡量測(cè)量精密度的計(jì)算液相色譜定量的準(zhǔn)確度誤差∶E=O-TO∶觀測(cè)到的值T∶真值準(zhǔn)確度的衡量色譜方法是相對(duì)定量方法,如不考慮損失及雜質(zhì)干擾等因素,其結(jié)果同“標(biāo)樣〞的準(zhǔn)確程度密切相關(guān)一般的衡量方法是做回收率實(shí)驗(yàn)或不同方法之間的比較：相關(guān)系數(shù)相關(guān)系數(shù)：其中，X及Y分別代表不同方法的實(shí)驗(yàn)值及平均值影響準(zhǔn)確度的因素峰面積的測(cè)量精度(積分誤差)校正因子的測(cè)量精度(標(biāo)準(zhǔn)曲線的r和r2)樣品的穩(wěn)定性和代表性,均勻性(樣品是否溶于流動(dòng)相)進(jìn)樣器的準(zhǔn)確度,進(jìn)樣技術(shù)色譜方法的可靠性(保存時(shí)間的重現(xiàn)性)色譜泵的精確度〔GPC的影響更大〕檢測(cè)器的靈敏度,線性范圍,檢測(cè)限進(jìn)樣技術(shù)對(duì)定量結(jié)果的影響固定體積定量管〔loop〕的進(jìn)樣器精度最好，其準(zhǔn)確度取決于進(jìn)樣器的結(jié)構(gòu)可變體積進(jìn)樣器的精度取決于操作者的技術(shù)，準(zhǔn)確度通常更高，因?yàn)檫M(jìn)樣用的注射器結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確度高，操作者的技術(shù)水平也有影響，但不大717plus及2695自動(dòng)進(jìn)樣器精確度及準(zhǔn)確度都可到達(dá)定量管進(jìn)樣器的水平，因?yàn)槠涿恳晃⑸?7步以上。然而它又保存了可變體積進(jìn)樣器的優(yōu)點(diǎn)校正曲線的檢測(cè)范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點(diǎn)都可能引起計(jì)算錯(cuò)誤定量校正曲線曲線A：因在零濃度時(shí)仍有色譜峰，

可能有雜質(zhì)未分開(kāi)曲線B：在此濃度內(nèi)，檢測(cè)器的響應(yīng)

值是非線性的曲線C：可接受的理想狀態(tài)，實(shí)際情

況應(yīng)是:其延長(zhǎng)線到零點(diǎn)曲線D：說(shuō)明有樣品的損失，可能是色譜柱的非特征吸附，也可能是樣品制備時(shí)的損失定量結(jié)果不正確的問(wèn)題定量結(jié)果不正確的問(wèn)題主要表現(xiàn)為以

下兩個(gè)方面:準(zhǔn)確度不好精密度不好定量結(jié)果不正確的問(wèn)題分析