寄生蟲病診斷課件

第七章寄生蟲病診斷第一節(jié)病原學診斷方法一、糞便蟲卵檢查法1.直接涂片法

directsmearmethod2.漂浮集卵法

flotationmethod3.沉淀集卵法

sedimentationmethod4.麥氏計數(shù)法

MacMastermethod5.毛蚴孵化法是診斷日本血吸蟲及東畢吸蟲的方法之一。6.糞便培養(yǎng)與幼蟲分離法圓線蟲目所屬線蟲種類很多，其蟲卵在形態(tài)上非常相似，很難區(qū)別。有時為了區(qū)別這些線蟲的種類，常將含有蟲卵的糞便加以培養(yǎng)，待其中蟲卵發(fā)育成為幼蟲時再檢查，根據(jù)幼蟲形態(tài)上的差異，加以鑒別。最常用的方法是在培養(yǎng)皿底部加草紙或濾紙1張，而后將欲培養(yǎng)的糞便加水調(diào)成硬糊狀，塑成半球形，放于皿內(nèi)的紙上，并使半球形糞球的頂部略高出平皿邊沿，使加蓋時與皿蓋相接觸。將此皿置25℃溫箱中，注意保持皿內(nèi)濕度（應使底部的墊紙保持潮濕狀態(tài)）。經(jīng)7天后，多數(shù)蟲卵即可發(fā)育成第三期幼蟲，并集中于皿蓋上的水滴中。將幼蟲吸出置載玻片上，放顯微鏡下檢查。有些寄生蟲（如網(wǎng)尾科線蟲），其蟲卵在新排出的糞便中已孵化為幼蟲；類圓屬線蟲蟲卵隨糞便排出后，在外界溫度較高時，經(jīng)5-12

h即孵出幼蟲。為了提高檢出率，常將幼蟲從糞便中分離出來進行檢查。常用的方法為漏斗幼蟲分離法亦稱貝爾曼法(Baermann'stechnique)7.測微技術(shù)各種蟲卵和幼蟲，大小通常較為恒定。蟲卵或幼蟲的大小可作為確定某一蟲卵或幼蟲的依據(jù)。蟲卵和幼蟲的測量需用測微器。長1mm的直線等分為100小格,每小格等于10μm10倍物鏡，標定后每小格是多少？1μm二、體表蟲體檢查法寄生于動物體表的寄生蟲主要有蜱、螨、虱等。對于它們的檢查，可采用肉眼觀察和顯微鏡觀察相結(jié)合的方法。蜱寄生于動物體表，個體較大，通過肉眼觀察即可發(fā)現(xiàn)。螨和虱有些個體較小，常需刮取皮屑，于顯微鏡下尋找蟲體或卵。三、生殖道蟲體檢查寄生于生殖道的蟲體主要有牛胎兒三毛滴蟲和馬媾疫錐蟲牛胎兒毛滴蟲存在于病母牛的陰道或子宮的分泌物，流產(chǎn)胎兒的羊水、羊膜或其第四胃內(nèi)容物中，也存在于公牛的包皮鞘內(nèi)，應采集以上各處的病料尋找蟲體。由于蟲體的檢定常以見到運動活潑的蟲體為準，故在采集病料時必須盡可能地避免污染，以免其它鞭毛蟲混入病料造成誤診。采集用的器皿和沖洗液等應加熱使接近體溫，否則蟲體驟然遇冷會失去活動力或死亡。沖洗液應采用以玻璃蒸餾裝置制備的蒸餾水配制生理鹽水，以保證沖洗液中不含金屬離子，減少金屬離子對蟲體的影響。病料采集后應盡快地進行檢查。由母畜采集病料，是取陰道分泌的透明粘液，以直接自陰道內(nèi)采取為良好，建議用一根長45厘米，直徑1.0厘米的玻璃管，在距一端的12厘米處，彎成150°角，而后消毒備用。使用時將管的“短臂”插入受檢畜的陰道，另端接一橡皮管并抽吸，少量陰道粘液即可吸入管內(nèi)。取出玻管，兩端塞以棉球，帶回實驗室檢查。收集公牛包皮沖洗液，應先準備100-150毫升加溫到30-35℃的生理鹽水，用針筒注入包皮腔。用手指將包皮口捏緊，用另一手按摩包皮后部，而后放松手指，將液體收集于廣口瓶中待查。流產(chǎn)胎兒，可取其第四胃內(nèi)容物，胸水或腹水檢查。檢查時應將收集到的病料，立即放于載玻片上，并防止材料干燥。對濃稠的陰道粘液，檢查前最好以生理鹽水稀釋2-3倍，羊水或包皮洗滌物最好先以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度離心沉淀5分鐘，而后以沉淀物制片檢查。未染色的標本主要檢查活動的蟲體，在顯微鏡下可見其長度略大于一般的白細胞，能清楚地見到波動膜，有時尚可見到鞭毛，在蟲體內(nèi)部可見含有一個圓形或橢圓形的有強折光性的核。波動膜常作為本蟲與其它一些非致病性鞭毛蟲和纖毛蟲在形態(tài)上相區(qū)別的依據(jù)。也可將標本固定，用姬氏染液或蘇木素染色后檢查。馬媾疫錐蟲在末梢血液中很少出現(xiàn)，因此血液學檢查在馬媾疫診斷上的用處不大。檢查材料主要應采取浮腫部皮膚或丘疹的抽出液，尿道及陰道的粘膜刮取物，特別在粘膜刮取物中最易發(fā)現(xiàn)蟲體。采取病料時，浮腫液和皮膚丘疹液用消毒的注射器抽取，為了防止吸入血液發(fā)生凝固，可于注射器內(nèi)先吸入適量的抗凝劑（2%檸檬酸鈉生理鹽水）。馬陰道粘膜刮取物的采取，先用陰道擴張器擴張陰道，再用長柄銳匙在其粘膜有炎癥的部位刮取，刮時應稍用力，使刮取物微帶血液，則其中容易檢到錐蟲。采取公馬尿道刮取物時，應先將馬保定，左手伸入包皮內(nèi)，以食指插入龜頭窩中，徐徐用力以牽出陰莖，用消毒的長柄銳匙插入尿道內(nèi)，刮取病料。以上所采的病料，均可加適量的生理鹽水，置載玻片上，覆以蓋玻片，制成壓滴標本檢查；也可制成抹片，用姬氏液染色后檢查。也可用滅菌紗布，以生理鹽水浸濕，用敷料鉗夾持，插入公馬尿道或母馬陰道，擦洗后，取出紗布，洗入無菌生理鹽水中，將鹽水離心沉淀，取沉淀物檢查，方法同上。四、血液和組織內(nèi)蟲體檢查法1.鮮血壓滴標本檢查2.涂片染色標本檢查3.蟲體濃集法涂片法雖然可以查到血液中的原蟲，但血液中的蟲體較少時，則不易查出蟲體。為此常先進行集蟲，再制片檢查。其操作過程是采病畜抗凝血6-7毫升，以每分鐘500轉(zhuǎn)的速度離心5分鐘，使其中大部分紅細胞沉降。而后將含有少量紅細胞，白細胞和蟲體的上層血漿移入另一離心管中，補加一些生理鹽水，以每分鐘2500轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘。取沉淀物制成抹片，按上述染色法染色檢查。此法適用于伊氏錐蟲病和梨形蟲病。其原理是錐蟲和感染有梨形蟲的紅細胞較正常紅細胞的比重為輕，所以在第一次沉淀時，正常紅細胞下降，而錐蟲和感染有梨形蟲的紅細胞尚懸浮在血漿中。第二次離心沉淀時，則將其濃集于管底。對于血液中的微絲蚴，也可用蟲體濃集法。方法是采血于離心管中。加入5%醋酸溶液以溶血。待溶血完成后，離心并吸取沉淀檢查。4.組織內(nèi)蟲體檢查法有些原蟲可以在動物身體的不同組織內(nèi)寄生。一般在死后剖檢時，取一小塊組織，以其切面在載玻片上做成抹片、觸片，或?qū)⑿K組織固定后制成組織切片，染色檢查。抹片或觸片可用瑞氏染色法或姬氏染液染色。泰勒蟲感染的病畜常呈現(xiàn)局部體表淋巴結(jié)腫大。取淋巴結(jié)穿刺物，進行顯微鏡檢查以尋找病原體，對本病的早期診斷很有幫助。其方法是，首先將病畜保定，用右手將腫大的淋巴結(jié)稍向上方推移，并用左手固定淋巴結(jié)。局部剪毛，消毒，以10毫升注射器和較粗的針頭刺入淋巴結(jié)，抽取淋巴組織；拔出針頭，將針頭內(nèi)容物推擠到載玻片上，涂成抹片，固定，染色，鏡檢，可以找到柯赫氏藍體。家畜患弓形蟲病時，除死后可在一些組織中找到包囊和速殖子外，生前診斷可取腹水，檢查其中滋養(yǎng)體的存在。收集腹水，豬只可采取側(cè)臥保定，穿刺部在白線下側(cè)臍的后方（公畜）或前方（母畜）1-2厘米處。穿刺時先局部消毒，將皮膚推向一側(cè)，針頭以略傾斜的方向向下刺入，深度約2-4厘米，針頭刺入腹腔后會感到阻力驟減，而后有腹水流出。取得的腹水可在載玻片上抹片，以瑞氏液或姬氏液染色后檢查。肌肉中旋毛蟲的檢查，是肉品衛(wèi)生檢驗的重要項目，世界各國使用的方法大同小異。傳統(tǒng)的方法為鏡檢法，但目前多用消化法。鏡檢法為取膈肌肉樣0.5~1g，剪成3×10mm的小塊，用厚玻片壓緊，放顯微鏡下檢查。消化法為取100g肉樣，攪碎或剪碎，放入3L的燒瓶內(nèi)。加入10g胃蛋白酶和2L自來水。然后加入16ml鹽酸（25%），放入1磁力攪拌棒。置于可加熱的磁力攪拌器上，設溫于44~46℃。30min后,將消化液用180μm的濾篩濾入一2L的分離漏斗,靜置30min,放出40ml液體于一50ml的量筒內(nèi),靜置10min,吸去30ml上清夜。加入30ml水，搖勻。10min后，再吸去30ml上清液。剩下的液體到入一帶有格線的平皿內(nèi)，用20-50倍顯微鏡觀察。五、動物接種法伊氏錐蟲

試驗動物可用小鼠、大鼠、豚鼠、兔或犬。其中尤以小鼠最適用。接種材料用可疑病畜的抗凝血液，血液采取后應在2-4小時內(nèi)接種完畢。接種量0.5-1.0毫升，可接種于腹腔或皮下。接種后的動物應隔離并經(jīng)常檢查。當病料中含蟲較多時，小鼠在接種后1-3日即可在其外周血液中查到錐蟲，當病料內(nèi)含蟲量少時，發(fā)病時間可能延長，因此接種后至少觀察一個月。也可于接種的第3天采接種小鼠的血液0.5~1.0毫升，接種于另一只小鼠，如此盲傳3代，即可在接種小鼠外周血內(nèi)發(fā)現(xiàn)蟲體。2.馬媾疫

馬媾疫錐蟲不能接種于多數(shù)實驗動物，但可將病畜的陰道或尿道刮取物與無菌生理鹽水混合，接種于公家兔的睪丸實質(zhì)中，每個睪丸的接種量為0.2毫升。如有馬媾疫錐蟲存在，經(jīng)1-2周后，即可見家兔的陰囊、陰莖、睪丸以及耳、唇周圍的皮膚發(fā)生水腫，并可在水腫液內(nèi)檢出蟲體。

3.胎兒毛滴蟲取病牛陰道分泌物或包皮沖洗液為病料，接種于妊娠豚鼠的腹腔內(nèi)，在接種后1-20天可以使妊娠豚鼠發(fā)生流產(chǎn)，在其流產(chǎn)胎兒的消化道和胎盤里可查出大量的毛滴蟲。4.弓形蟲弓形蟲是多宿主病原原蟲，多種家畜和實驗動物均具有易感性，但小鼠對之特別敏感，常常僅數(shù)十個蟲體即可使小鼠感染發(fā)病。一般取急性死亡的可疑動物的肺、淋巴結(jié)、脾、肝或腦組織，以1:5的比例加入生理鹽水，制成乳劑，并加少量青霉素和鏈霉素以控制細菌感染。吸取乳劑0.2毫升接種于小鼠腹腔，一般急性者在4-5天后發(fā)病。病鼠被毛粗亂，食欲消失，腹部膨大，有大量腹水，病程4-5天，最后死亡。抽取病鼠或病死鼠的腹水作涂片，染色檢查，可見大量游離的滋養(yǎng)體。六、動物剖檢法1.全身剖檢法在動物死亡（或捕殺）后，首先制作血片，染色檢查，觀察血液中有無寄生蟲，而后仔細檢查體表，觀察有無體表寄生蟲。而后剝皮，觀察皮下組織中有無蟲體寄生。將各內(nèi)部臟器依次取出，先收集胸水，腹水，沉淀后觀察其中有無寄生蟲。而后取出全部消化器官及其所附的肝、胰等腺體。取出呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)、心臟和大的動脈和靜脈血管，分別進行檢查。

消化系統(tǒng)

先將附著其上的肝、胰取下，再將食道、胃（反芻獸應將四個胃分開）、小腸、大腸、盲腸分別結(jié)扎后分離。

呼吸器官用剪刀將鼻、喉、氣管、支氣管切開，尋找蟲體。用小刀刮氣管粘膜，刮下物在解剖鏡下檢查。肺組織按肝臟處理方法。泌尿器官切開腎，先對腎盂作肉眼檢查，再刮取腎盂粘膜檢查。最后將腎實質(zhì)切成薄片，壓于兩玻片間，在放大鏡或解剖鏡下檢查。剪開輸尿管，膀胱和尿道，檢查其粘膜，并注意粘膜下有無包囊。收集尿液，用反復沉淀法處理。

生殖器官切開并刮取粘膜，壓片檢查。懷疑為馬媾疫和牛胎兒毛滴蟲病時，應涂片染色后油鏡檢查。

腦先肉眼檢查有無多頭蚴，再切成薄片，壓片檢查眼結(jié)膜和結(jié)膜腔以括搔法處理檢查。剖開眼球，將前房水收集于皿中，在放大鏡下檢查。

心和主要血管剖開將內(nèi)容物洗于生理鹽水中，反復用沉淀法檢查（對血管內(nèi)分體吸蟲的收集見后）。膈腳特別是豬，應用鏡檢法和消化法進行檢查。2.個別器官和個別寄生蟲剖檢法有時為了特定的目的，僅對某一器官或某一器官中的某種寄生蟲進行檢查，如調(diào)查某一地某一器官中寄生蟲寄生的情況，或調(diào)查某一地區(qū)某種寄生蟲的流行情況，或考核某一藥品對某種寄生蟲的驅(qū)蟲效果。其剖檢方法同全身剖檢法。第二節(jié)免疫學診斷方法免疫學診斷：應用免疫學的理論、技術(shù)和方法診斷各種疾病和測定免疫狀態(tài)。抗原抗體反應T細胞殺傷反應補體介導的反應已報道的寄生蟲免疫學診斷方法很多，包括變態(tài)反應、沉淀反應、凝集反應、補體結(jié)合試驗，免疫熒光抗體技術(shù)、免疫酶技術(shù)、放射免疫分析技術(shù)、免疫印跡技術(shù)等。此處僅介紹主要幾種。一、間接血凝試驗1.基本原理

間接血凝試驗(Indirectheamagglutinationassay，IHA)是將可溶性抗原或抗體先吸附于紅細胞表面，然后與相應的抗體或抗原作用，在適宜的條件下由于抗原抗體的特異性結(jié)合，會帶動紅細胞的凝集，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱間接血凝試驗。紅細胞自然沉降，陰性被致敏的紅細胞與被檢血清反應，形成復合物，而不沉降，陽性（1）用微量滴管加4滴（25μl/滴）生理鹽水于U型微量血凝板第一排第二孔內(nèi)，第三孔空白，第四孔加1滴。（2）第一孔內(nèi)加待檢血清，混勻，從中吸取血清1滴加入第二孔內(nèi)，充分混勻后吸出2滴，于第三孔和第四孔各加1滴，在第四孔混勻后棄去1滴，使第三孔和第四孔血清稀釋度為1∶5和1∶10。（3）將凍干致敏紅細胞用蒸餾水稀釋后，用定量吸管吸取致敏紅細胞懸液，于第三孔和第四孔各加一滴（25μl），立即旋轉(zhuǎn)震搖2min，室溫下靜置1h左右，觀察結(jié)果。（4）判讀標準以血清大于或等于1:10稀釋出現(xiàn)陽性反應判為血吸蟲病患者。二、免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescencemethod)又稱熒光抗體標記技術(shù)(Fluorescent-labelledantibodytechnique)，是指用熒光素對抗體或抗原進行標記，然后用熒光顯微鏡觀察所標記的熒光以分析示蹤相應的抗原或抗體的方法。判定結(jié)果時，-為無熒光，+為熒光弱但清楚可見，++為熒光明亮，+++~++++為熒光強而明亮。A：++++；B：+++；C：:+；D：陰性對照目前，熒光免疫技術(shù)已在許多寄生蟲病中得到應用。如血吸蟲病、錐蟲病、旋毛蟲病、弓形蟲病、利什曼病等。弓形蟲速殖子抗原片的制備用適量生理鹽水稀釋弓形蟲速殖子全蟲，滴于載玻片上，顯微鏡下觀察，至視野中的蟲體均勻散在，每個高倍視野100個蟲體左右（1×107/mL）。用移液器吸取上述稀釋好的蟲體30μL，滴于載玻片每個反應孔區(qū)內(nèi)，靜置30min，吸去孔區(qū)內(nèi)多余的液體，空氣中自然晾干后，冷丙酮固定10min，自然干燥5～10min，用錫紙包裝后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

弓形蟲速殖子免疫熒光專用載玻片將待檢血清稀釋后，取30μL加入抗原片反應區(qū)內(nèi)，置濕盒內(nèi)室溫反應30min，用PBS漂洗3次，每次5min，自然涼干。滴加用PBS稀釋的FITC標記二抗30μL，濕盒內(nèi)室溫反應30min，同上洗滌、晾干。再加PBS稀釋的伊文斯藍（0.02%）30μL，濕盒內(nèi)室溫反應5min，PBS洗1次，5min，晾干。各反應區(qū)內(nèi)滴加90%的磷酸鹽緩沖甘油一滴，覆以蓋玻片，熒光顯微鏡下檢查。弓形蟲IFA結(jié)果A：一抗1:60稀釋時檢測結(jié)果；B：一抗1:120稀釋時檢測結(jié)果；C：:一抗1:480稀釋時檢測結(jié)果；D：陰性對照檢測結(jié)果三、免疫酶技術(shù)酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫學反應的特異性，也不影響酶本身的酶學活性。酶標抗體或抗原與相應的抗原或抗體結(jié)合后，形成酶標抗體-抗原復合物。復合物中的酶在遇到相應的底物時，催化底物分解，使供氫體氧化而生成有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的出現(xiàn)，客觀地反映了酶的存在。根據(jù)有色產(chǎn)物的有無及其濃度，即可間接推測被檢抗原或抗體是否存在以及其數(shù)量，從而達到定性或定量的目的。免疫酶技術(shù)在方法上分為兩類，一類用于組織細胞中的抗原或抗體成分檢測和定位，稱為免疫酶組織化學或免疫酶染色法，另一類用于檢測液體中可溶性抗原或抗體成分，稱為免疫酶測定法。免疫組織化學標本制備后，先將內(nèi)源酶抑制，然后進行免疫酶染色檢查。其基本原理和方法與抗體法相同，只是以酶代替熒光素作為標記物，并以底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物為標志。常規(guī)免疫酶染色法可分為直接和間接兩種方法。直接法是用酶標記特異性抗體，直接檢測寄生蟲或其抗原。在含有寄生蟲或其抗原的標本固定后，消除其中的內(nèi)源性酶，用酶標記的抗體（直標一抗）直接處理，使標本中的抗原與酶標抗體結(jié)合，然后加底物顯色，進行鏡檢。間接法

是將含有寄生蟲或其抗原的組織或細胞標本，用特異性抗體處理，使抗原抗體結(jié)合，洗滌清除未結(jié)合的部分，再用酶標記的抗抗體(酶標二抗)進行處理，使其形成抗原抗體-酶標記抗抗體復合物，最后滴加底物顯色，進行鏡檢。間接法雖然多一步驟，但比直接法特異性強，使用范圍更廣。酶標記第二抗體可用葡萄球菌A蛋白SPA或生物素與親合素系統(tǒng)等代替，亦成功地用于許多抗原和抗體的檢測。同時在不同程度上提高了檢測方法的特異性與敏感性。免疫酶測定法分固相免疫酶測定法和均相免疫酶測定法兩類固相免疫酶測定法是需用固相載體，以化學的或物理的方法將抗原或抗體連接其上，制成免疫吸附劑，隨后進行免疫酶測定。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是固相免疫酶測定法中應用最廣泛的一種。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorb