超氧陰離子(Oxygenfreeradical,OFR)試劑盒說明書

第第頁超氧陰離子（Oxygenfreeradical,OFR）試劑盒說明書超氧陰離子（Oxygenfreeradical,OFR）試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個預(yù)期差別大的樣本做猜測定。測定意義：生物體內(nèi)超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號傳導(dǎo)的作用，但積累過多時會對細(xì)胞膜及生物大分子產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。測定原理：超氧陰離子與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2—，NO2—在對氨基苯磺酸和α—萘胺的作用下，生成紅色的偶氮化合物，在530nm處有特征汲取峰，依據(jù)ΔA值可以計算樣品中O2—含量，反應(yīng)式為NH2OH+2O2—＋H＋→NO2—＋H2O2＋H2O。自備試驗(yàn)用品及儀器：天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、氯仿和蒸餾水。試劑構(gòu)成和配制：提取液：液體110mL×1瓶，4℃保管。試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保管。試劑二：液體15mL×1瓶，4℃避光保管。試劑三：液體15mL×1瓶，4℃避光保管。試劑四：氯仿，自備。超氧陰離子提取：1.植物、動物組織：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后，10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測。2.細(xì)菌、真菌：依照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波碎裂細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測。3.血清或培養(yǎng)液：直接測定。測定操作表：分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)整波長至530nm。1、操作表空白管測定管樣本（μL）200提取液（μL）200試劑一（μL）160160混勻，37℃水浴20min試劑二（μL）120120試劑三（μL）120120混勻，37℃水浴20min試劑四（μL）200200混勻，8000g，25℃，離心5min，小心吸取上層水相200μL于微量石英比色皿/96孔板中，測定A530。ΔA=A測定A空白，空白管只要做一管。超氧陰離子含量計算公式a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0242x0.0027，R2=0.99801.組織：（1）依照樣本質(zhì)量計算超氧陰離子含量（nmol/g鮮重）=（ΔA+0.0027）÷0.0242×V反總÷（V樣÷V樣總×W）×2=148.76×（ΔA+0.0027）÷W超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/g·min）=148.76×（ΔA+0.0027）÷W÷T=7.44×（ΔA+0.0027）÷W（2）依照蛋白質(zhì)濃度計算超氧陰離子含量（nmol/mgprot）=（ΔA+0.0027）÷0.0242×V反總÷（V樣×Cpr）×2=148.76×（ΔA+0.0027）÷Cpr超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/mgprot·min）=148.76×（ΔA+0.0027）÷Cpr÷T=7.44×（ΔA+0.0027）÷Cpr2.細(xì)菌，真菌：超氧陰離子含量（nmol/104cell）=（ΔA+0.0027）÷0.0242×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）×2=148.76×（ΔA+0.0027）÷細(xì)胞數(shù)量超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/104cell·min）=148.76×（ΔA+0.0027）÷細(xì)胞數(shù)量÷T=7.44×（ΔA+0.0027）÷細(xì)胞數(shù)量3.血清或培養(yǎng)液超氧陰離子含量（nmol/mL）=（ΔA+0.0027）÷0.0242×V反總÷V樣×2=148.76×（ΔA+0.0027）超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/mL·min）=148.76×（ΔA+0.0027）÷T=7.44×（ΔA+0.0027）V樣總：加入提取液體積，1mL；V反總：反應(yīng)總體積，0.36mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，20min；2:2分子O2—參加反應(yīng)生成1分子NO2—。b.用96孔板測定的計算公式如下標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0121x0.0027，R2=0.99801.組織：（1）依照樣本質(zhì)量計算超氧陰離子含量（nmol/g鮮重）=（ΔA+0.0027）÷0.0121×V反總÷（V樣÷V樣總×W）×2=297.52×（ΔA+0.0027）÷W超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/g·min）=297.52×（ΔA+0.0027）÷W÷T=14.88×（ΔA+0.0027）÷W（2）依照蛋白質(zhì)濃度計算超氧陰離子含量（nmol/mgprot）=（ΔA+0.0027）÷0.0121×V反總÷（V樣×Cpr）×2=297.52×（ΔA+0.0027）÷Cpr超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/mgprot·min）=297.52×（ΔA+0.0027）÷Cpr÷T=14.88×（ΔA+0.0027）÷Cpr2.細(xì)菌，真菌：超氧陰離子含量（nmol/104cell）=（ΔA+0.0027）÷0.0121×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）×2=297.52×（ΔA+0.0027）÷細(xì)胞數(shù)量超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/104cell·min）=297.52×（ΔA+0.0027）÷細(xì)胞數(shù)量÷T=14.88×（ΔA+0.0027）÷細(xì)胞數(shù)量3.血清或培養(yǎng)液超氧陰離子含量（nmol/mL）=（ΔA+0.0027）÷0.0121×V反總÷V樣×2=297.52×（ΔA+0.0027）超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/mL·min）=297.52×（ΔA+0.0027）÷T=14.88×（ΔA+0.0027）V樣總：加入提取液體積，1mL；V反總：反應(yīng)總體積，0.36mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，