hsvk基因?qū)Ρ貘B苷細胞凋亡的影響

hsvk基因?qū)Ρ貘B苷細胞凋亡的影響

單尾流行病毒（hsv）胸腺酪氨酸酶（tk）/丙氧化鉀（tcv）自我釋放基因系統(tǒng)在各種腫瘤的實驗基因治療中取得了顯著療效，并用于腦腫瘤的臨床實踐基因治療。但在這個系統(tǒng)中還有許多問題尚未解決,如含HSV-TK基因的不同細胞對GCV敏感性不同的原因、受GCV作用的細胞發(fā)生凋亡還是壞死、攜TK基因腫瘤細胞鼠移植瘤接受GCV治療后對同源腫瘤細胞產(chǎn)生特異性免疫的機制等。我們將TK基因轉入多個細胞系,對這些問題進行初步探討。材料和方法一、病毒載體和測試劑人胰腺癌細胞系PC-2和PC-7為我科自建,豬腎小管上皮細胞系LLC-PK1(簡稱PK1)由協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科實驗室提供;含HSV-TK基因全長cDNA的重組逆轉錄病毒載體新霉素阻抗基因胸腺嘧啶核苷激酶(NTK)由美國BedfordMemorialVeterans醫(yī)院Dr.Moolten惠贈;含β-半乳糖苷酶基因的對照重組逆轉錄病毒載體NCMVβ為我科自備。neo基因擴增引物:N1:5′-AGAGGCTATTCGGCTATGAC-3′和N2:5′-GATACTTTCTCGGCAGGAG-3′由Cybersyn公司合成,擴增產(chǎn)物為292bp;GCV由美國加州Syntex公司惠贈;原位凋亡檢測試劑盒為BoehringerMannheim公司產(chǎn)品;4周齡雌性Balb/c裸鼠購自中國科學院動物所。二、藥物作用裸鼠移植瘤的檢測1.質(zhì)粒DNA的轉染:PC-2、PC-7及PK1細胞用含10%胎牛血清(Gibco公司)的RPMI1640培養(yǎng)基,在37℃5%CO2條件下培養(yǎng),當貼壁生長的細胞達50%～60%融合時,用Lipofectin介導的DNA轉染方法,將重組逆轉錄病毒載體新霉素阻抗基因胸腺嘧啶核苷激酶(NTK)及對照NCMVβ分別直接導入3個靶細胞系,經(jīng)G418(600μg/ml)篩選2～3周后得到抗藥性克隆,隨機挑取克隆擴大培養(yǎng),分別命名為PC-2/NTK、PC-7/NTK和PK1/NTK。2.聚合酶鏈反應(PCR)擴增neo基因:按“分子克隆實驗指南”方法提取細胞基因組DNA,50μl反應體系含:0.5μg模板DNA,上、下游引物各0.5μg,1×PCR緩沖液,1.5mmol/LMgCl2,2.0mmol/LdNTP及5UTaqDNA聚合酶,采用94℃變性1min,59℃退火1min;72℃延伸1min的條件,擴增36個循環(huán),產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析,以未轉染的PC-2細胞作陰性對照,以含neo基因的NTK質(zhì)粒為陽性對照。3.Northernblot分析TK基因表達:以NTK載體中的TKcDNA片段為探針,細胞總RNA的提取采用異硫氰酸胍一步法,RNA的電泳、轉膜及cDNA的標記與雜交參閱文獻。4.β-半乳糖苷酶表達檢測:參閱文獻。5.計算細胞倍增時間:細胞以1.5×104/孔接種24孔板,每種細胞3孔,4d后用錐蟲藍(又稱臺盼藍)染料排除法計數(shù)活細胞,倍增時間=時間(h)/細胞分裂次數(shù)(n),n=ln(p/x)/ln2(p為n次分裂后的細胞數(shù),x為細胞接種數(shù))。6.噻唑藍(MTT)法檢測轉化細胞對前體藥物的敏感度及IC50值:GCV濃度取0、0.1、0.5、1、5、10、100、500、750、1000μmol/L,按Osaki等的方法進行檢測,細胞存活率=用藥組吸光度(A,曾稱光密度OD)值/非用藥組A值×100%,細胞生長抑制率=(1-用藥組A值/非用藥組A值)×100%。經(jīng)Slide軟件處理得出藥物劑量-反應曲線,求出50%細胞受抑制時的藥物濃度,即IC50值。7.流式細胞術檢測細胞周期:收集約1×106個細胞,70%預冷乙醇固定過夜,RNase消化后碘化丙錠(PI)標記,在Coulter公司EPICS流式細胞儀上進行DNA含量分析,檢測細胞碎片或凋亡細胞及細胞周期。8.藥物作用細胞的形態(tài)觀察與原位凋亡檢測:用20μmol/LGCV對NTK轉染細胞作用5d后,進行形態(tài)觀察,并按試劑盒介紹的方法進行原位凋亡檢測。9.藥物作用裸鼠移植瘤的光鏡及電鏡觀察:6只4周齡雌性Balb/c裸鼠左側背部皮下接種1×107個PC-2細胞,右側接種1×107個PC-2/NTK細胞,2周后瘤體可觸及時(約0.3cm～0.4cm),其中3只腹腔內(nèi)注射GCV,150mg/kg,2次/d,共5d,另3只作為對照腹腔內(nèi)注射PBS,停藥后6～8周比較瘤體大小。取GCV作用組PC-2/NTK細胞移植瘤制成標本,在光鏡和電鏡下觀察細胞形態(tài)。10.統(tǒng)計學處理用方差分析。結果1.pc-2細胞外源基因表達G418篩選后所得PC-2/NTK、PC-7/NTK和PK1/NTK細胞株PCR檢測,可見292bp的neo基因擴增產(chǎn)物和154bp的Ki-ras內(nèi)參照擴增產(chǎn)物,未轉化的PC-2細胞只見Ki-ras擴增產(chǎn)物,表明外源基因已進入轉化的PC-2細胞(圖1)。Northernblot雜交分析可見各轉染細胞中均有1.3kbTKmRNA雜交帶,證實外源TK基因可以有效表達且表達量基本相同(圖2)。對NCMVβ轉染各細胞進行β-半乳糖苷酶組織化學檢測,可見其轉染的PC-2、PC-7及PK1細胞均呈藍色,表明對照NCMVβ載體已進入細胞并表達。2.外源基因整合與表達對細胞生長速度的影響對各轉染前后細胞的倍增時間進行檢測,發(fā)現(xiàn)(表1)各轉染細胞與相應的未轉染細胞彼此間差異無顯著性(方差分析,P>0.05),表明外源基因的整合與表達對細胞生長速度無影響;但PC-2、PC-7、PK13種細胞間則差異有顯著性(P<0.05),增殖速度順序為PK1>PC-2>PC-7。3.tk基因突變細胞對gcv的敏感性檢測MTT法檢測示(表2),PC-2/NTK、PC-7/NTK、PK1/NTK的IC50值分別為(0.93±0.16)、(1.22±0.06)、(0.73±0.12)μmol/L,均低于相應未轉染細胞和對照質(zhì)粒轉染細胞600～800倍,差異有顯著性(方差分析,P<0.01),表明含TK基因細胞對GCV的敏感性明顯增高。但NTK轉染的PC-2、PC-7、PK1細胞之間對GCV的敏感性有所不同,PK1/NTK與PC-2/NTK和PC-7/NTK的IC50值差異有顯著性(P<0.05),PC-2/NTK與PC-7/NTK間的IC50值雖無明顯差異,但亦是升高趨勢,這種IC50值PK1/NTK<PC-2/NTK<PC-7/NTK的趨勢與倍增時間PK1<PC-2<PC-7呈正相關。經(jīng)流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)受GCV作用的PC-2/NTK細胞與對照PC-2細胞比較,S期抬高,表明較多細胞被阻滯在S期,占21.8%,高于PC-2細胞的4.9%,證實GCV對增殖旺盛的細胞作用更加明顯(圖3)。4.gcv基因突變試驗從流式細胞術分析結果還可看出,轉染細胞經(jīng)GCV作用后,壞死細胞碎片增多,未見凋亡細胞峰。光鏡觀察20μmol/LGCV作用5d的NTK轉染細胞,可見多數(shù)細胞腫大,胞質(zhì)發(fā)空,核亦腫脹,趨于溶解,部分細胞已飄浮死亡(圖4～6);原位凋亡檢測發(fā)現(xiàn)個別細胞呈亮綠熒光。裸鼠體內(nèi)GCV藥物敏感試驗顯示:PC-2/NTK細胞移植瘤在注射GCV后生長停止并逐漸縮小,而處于同種體內(nèi)環(huán)境下的PC-2細胞移植瘤則不受GCV影響,腹腔應用PBS的對照組移植瘤亦是不斷生長。將受GCV作用的剩余PC-2/NTK移植瘤取下,HE染色后光鏡觀察發(fā)現(xiàn)為大片壞死組織(圖7,8)。電鏡觀察可見大多數(shù)細胞表現(xiàn)為壞死,少數(shù)細胞為凋亡。轉染細胞的敏感性本研究再次證實了HSV-TK/GCV系統(tǒng)對胰腺癌細胞的體外和裸鼠體內(nèi)的細胞殺傷作用。該系統(tǒng)基因治療的原理是:導入細胞的HSV-TK基因表達產(chǎn)物可以將核苷類似物GCV磷酸化,生成單磷酸化物,后者再由細胞的磷酸激酶轉化成二磷酸或三磷酸化物,抑制DNA聚合酶的功能或競爭性地摻入DNA,造成DNA合成終止,細胞死亡,故該系統(tǒng)是將細胞阻滯在S期。流式細胞術分析結果顯示:在GCV作用下,較多細胞被阻滯在S期,證實了這一點。由于增殖旺盛的細胞處于S期的較多,HSV-TK/GCV系統(tǒng)應對增殖旺盛的細胞作用更為明顯,我們的藥敏試驗結果的確體現(xiàn)了這一規(guī)律,IC50值隨著不同細胞倍增時間的增加而上升,受同一逆轉錄病毒載體轉染的不同細胞對GCV敏感度不同。許多其他研究者亦觀察到了該現(xiàn)象。這對HSV-TK/GCV系統(tǒng)應用于臨床試驗治療時對病人或腫瘤的選擇具有指導意義。在本試驗中檢測到PC-2/NTK與PC-7/NTK對GCV的敏感性與倍增時間呈正相關,但差異無顯著性。這可能是由于PC-2與PC-7細胞倍增時間的差異雖有顯著意義,但其差值較PK1細胞與二者倍增時間的差值小,故需擴大試驗規(guī)模進行再次統(tǒng)計。PK1為豬腎小管上皮細胞,有可能恰恰是種系的不同造成了PK1與PC-2及PC-7細胞倍增時間差異較大,從而對GCV顯示出更大的敏感性。目前認為藥物敏感基因?qū)е履[瘤細胞死亡的途徑有兩種:一是前體藥物誘導細胞發(fā)生凋亡;另一是前體藥物導致細胞發(fā)生壞死。由于藥敏基因治療的最終目的是殺傷細胞,因此細胞死亡途徑開始并未引起重視,但近年有關藥敏基因體內(nèi)治療可引起機體對同源未轉染細胞的長期免疫,以及藥敏基因治療引起局部淋巴細胞浸潤,聯(lián)合應用藥敏與免疫基因治療可以顯著提高療效等報道不斷涌現(xiàn),而細胞死亡途徑的闡明有助于免疫現(xiàn)象的解釋,故而引起重視。我們通過流式細胞術、光鏡和電鏡檢測發(fā)現(xiàn),