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文檔簡介
其次局部堿性磷酸酶Km測定一、試驗?zāi)康陌盐諌A性磷酸酶的的動力學鑒定—Km鑒定二、試驗原理當溫度、pH及酶濃度恒定的條件下,酶促反響的初速度隨作用物濃度[S]增大而增大,但增大到肯定限度時,作用物濃度再增加,則反響速度不再增加。此時反響速度為最大速度〔Vmax〕。MichaelisMenten對酶促反響速度與作用物濃度之間的這種關(guān)系進展了大量試驗爭論,并于1913年提出了數(shù)學方程式,即著名的米一曼方程式:
作圖后,將各點連線延長,直線與橫軸的交點為1/Km,依據(jù)在橫軸上的截距,可以計算出該酶的Km。
本試驗以堿性磷酸酶為例,用磷酸苯二鈉為其作用物,堿性磷酸酶能分解磷酸苯二鈉產(chǎn)生酚和磷酸,酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用,經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色的醌衍生物,依據(jù)紅色深淺可測出酶活力凹凸。其反響式如下:
磷酸苯二鈉磷酸鹽+酚AKP酚+4-氨基安替比林紅色醌類衍生物鐵氰化鉀PH10堿性利用在不同作用物濃度的條件下,測定的酶活性〔A〕,按Lieweaver-Burk二氏法作圖,從x軸上的截距求得其Km值。三、試驗儀器及試劑儀器:恒溫水浴鍋,721型分光光度計。試劑:
1.0.04mol/L作用物液:稱取10.16g磷酸苯二鈉〔C6H5PO4Na2·2H2O〕,用煮沸后冷卻的蒸溜水溶解,并稀釋至1,000ml,4ml氯仿防腐,加貯于棕色瓶內(nèi),置冰箱內(nèi)保存,可用一周。
2.0.1mol碳酸鹽緩沖液〔pH10.0〕:稱取無水碳酸鈉6.36g及碳酸氫鈉3.36g,溶解于蒸餾水中,并稀釋至1,000ml.
3.堿性磷酸酶液:用自己提取的堿性磷酸酶液,用
pH10緩沖液稀釋
5-7倍。0.5mol/LNaOH
溶液0.3%4-氨基安替比林:稱取
3g4氨基安替比林及碳酸氫鈉
42g,用蒸餾水溶解,并稀釋至
1,000ml,貯于棕色瓶中,放冰箱內(nèi)保存。0.5%鐵氰化鉀:稱取
10g鐵氰化鉀及
30g硼酸各溶于
800ml蒸餾水中,溶解后兩液混合加水至
2,000ml。置棕色瓶中,放冰箱內(nèi)保存。四、操作步驟1、取大試管
7支,按下表操作:參加酶液,混勻之后馬上計時,各管在37℃水浴中準確保溫15分鐘后,立即參加0.5MolNaOH液1.0ml以終止反響。
2、顯色:各管中參加0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%鐵氰化鉀2.0ml,充分混勻,放置10分鐘,以0管為比照,在波長510nm下比色,記錄各管的吸光度。3、作圖:所測各管的吸光度代表各管中反響速度V,以之為縱軸,以作用物濃度[S]為橫軸,在坐標紙上連接各點作圖,觀看曲線的外形。以各管吸光度值的倒數(shù)為縱坐標,以作用物濃度的倒數(shù)為橫坐標,作圖并求此酶的Km值。五、試驗結(jié)果〔1〕說說堿性磷酸酶提取過程中的留意事項〔2〕計算堿性磷酸酶的Km值單項選擇題:1.下面關(guān)于酶的描述,哪一項不正確:A
A、全部的酶都是蛋白質(zhì)
B、酶是生物催化劑
C、酶具有專一性
D、酶是在細胞內(nèi)合成的,但也可以在細胞外發(fā)揮催化功能2.一個簡潔的米氏酶催化反響,當[S]<<Km時:B
A、反響速度最大
B、底物濃度與反響速度成正比
C、增加酶濃度,反響速度顯著變大
D、[S]濃度增加,Km值也隨之變大3.酶的比活力是指:B
A、任何純酶的活力與其粗酶的活力比
B、每毫克蛋白的酶活力單位數(shù)
C、每毫升反響混合液的活力單位
D、以某種酶的活力作為1來表示其他酶的相對活力是非題:1.假設(shè)有一個適
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