連續(xù)培養(yǎng)大腸桿菌dh5及其突變株da19對葡萄糖的吸收和平衡

連續(xù)培養(yǎng)大腸桿菌dh5及其突變株da19對葡萄糖的吸收和平衡

對大腸桿菌代謝工程的影響dh5是常見的山羊細(xì)菌，但其基本培養(yǎng)基中的生長不好，含有大量醋酸。其乙酸耐受突變株DA19的生長和乙酸積累都得到明顯改善,研究二者代謝差異對大腸桿菌的代謝工程有指導(dǎo)意義。DH5α在碳源限制的基本培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)時非常容易被生長得率提高的突變株取代,而在氮源限制下即使發(fā)生這樣的突變,也不會顯示生長優(yōu)勢被富集,而且碳源的過量更有利于研究乙酸生產(chǎn)的特點。本研究在氮源限制的基本培養(yǎng)基中進行了大腸桿菌DH5α及DA19的連續(xù)培養(yǎng),比較了它們代謝流分布的差異,并結(jié)合酶活測定的結(jié)果,分析了造成二者代謝差異的原因。1材料和方法1.1hsdr17reca1nda15大腸桿菌DH5α[supE44ΔlacU169(80lacZΔM15)hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1relA1]。DA19是DH5α的耐乙酸突變株,由本實驗室篩選。1.2含na2hpo412h2oLB培養(yǎng)基(1L)含蛋白胨(英國Oxiod公司)10g,酵母抽提物(Oxiod公司)5g,NaCl10g,pH7.2。M培養(yǎng)基(1L)含Na2HPO4·12H2O15.12g,KH2PO43g,NaCl0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,CaCl20.011g,葡萄糖2g,氯化銨1g,10g·L-1維生素B10.2ml,微量元素混合液0.2ml,pH7.0。MN培養(yǎng)基為氮源限制的M培養(yǎng)基,1L中含葡萄糖8g,氯化銨0.3g,其他成分與M培養(yǎng)基相同。MNA培養(yǎng)基為添加了3g·L-1乙酸鈉的MN培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基都采用去離子水配制。1.3連續(xù)培養(yǎng)和培養(yǎng)過程將1ml冷凍保存的菌種接入250ml錐形瓶里的30mlLB培養(yǎng)基中,旋轉(zhuǎn)搖床30℃,250r·min-1培養(yǎng)12h為一級種子。轉(zhuǎn)接3ml一級種子于裝有100mlM培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中,相同條件DA19培養(yǎng)10h,DH5α培養(yǎng)17h,為二級種子。連續(xù)培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐(RIBE-5,華東理工大學(xué))中進行,利用國家生化工程技術(shù)研究中心(上海)的TopHawk軟件由計算機控制和采集在線數(shù)據(jù)。發(fā)酵罐裝2.5LMN或MNA培養(yǎng)基,接入二級種子200ml,在攪拌轉(zhuǎn)速500r·min-1,通氣量4L·min-1,溫度30℃下分批培養(yǎng)至靜止期,用2臺蠕動泵分別以相同速率加入新鮮培養(yǎng)基和抽出培養(yǎng)液,使連續(xù)培養(yǎng)的總體積恒定(約2.1L)。培養(yǎng)過程DO不低于30%。每隔4h取樣測定菌體濃度、葡萄糖濃度和pH,連續(xù)3次不變即認(rèn)為到達穩(wěn)態(tài)。1.4細(xì)胞破碎后各酶的檢測菌體濃度采用濁度法,將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后測OD600,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菌體干重。葡萄糖濃度采用葡萄糖測定試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所)測定。銨離子濃度采用Berthelot法比色測定。乙酸和丙酮酸濃度采用離子色譜(美國Dionex公司ICS1500離子色譜儀,IonpacAS11-HC4×250mm陰離子分析柱和IonpacAG11-HC4×50mm保護柱,電導(dǎo)檢測器檢測)。乙醇濃度采用氣相色譜方法測定(GC112A,Chromosorib101填充柱)。對細(xì)胞破碎后的6-磷酸葡萄糖脫氫酶、磷酸果糖激酶、異檸檬酸脫氫酶、乙酸激酶和異檸檬酸裂解酶進行測定。每一種酶的酶活為3次測定的平均值。1.5生物前體及代謝流分布的計算大腸桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)主要包括糖酵解(EMP)、三羧酸循環(huán)(TCA)、磷酸戊糖(PP)途徑、補給途徑和乙酸途徑,見圖1。大腸桿菌通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)攝取葡萄糖,每攝取1mol葡萄糖消耗1molPEP并生成1mol丙酮酸。PP途徑不僅為生物大分子合成提供前體,而且還為生物合成提供還原力——NADPH,當(dāng)菌體產(chǎn)生的NADPH過量時,通過反應(yīng)22把NADPH轉(zhuǎn)換為NADH,經(jīng)呼吸鏈氧化。因異檸檬酸裂解酶受到葡萄糖的阻遏,過量葡萄糖存在下不考慮該途徑。用于形成菌體的前體需求根據(jù)大腸桿菌的菌體組成計算。本研究采用物料平衡法計算代謝流分布。根據(jù)各節(jié)點代謝物的流量平衡,有Ax(t)=r(t)(1)式中A為m×n的化學(xué)計量系數(shù)矩陣,x(t)為n維流量向量,r(t)為m維代謝物濃度變化率/攝取率/生產(chǎn)率向量。本研究分析連續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)態(tài)下的流量分布,中間代謝物濃度恒定,與胞外交換的代謝物流量可測得,因此流量分布的計算為由式(1)得到的線性方程組的解。根據(jù)圖1,對中間代謝物建立了包括22個未知流量的22個方程,具有唯一解。2結(jié)果與討論2.1菌株代謝和活性DH5α和DA19連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)態(tài)結(jié)果見表1。在各實驗中,連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)態(tài)銨離子濃度均為0,反映了銨的限制。在MN中,DA19關(guān)于葡萄糖的得率系數(shù)(YX/S)比DH5α提高了24%,而葡萄糖比消耗速率(QS)、乙酸和丙酮酸比生成速率(QAC、QPyr)都有所降低。添加乙酸鈉后,菌體傾向于避免自身乙酸的形成,因此二者在MNA培養(yǎng)基中的乙酸比生成速率比在MN培養(yǎng)基中低,而YX/S下降,QS和QPyr增加,但DH5α的QPyr增加了67%,而DA19僅增加24%。這都表明DA19提高了葡萄糖的利用效率,代謝效率明顯提高。除了乙酸外,兩個菌株在MN和MNA中連續(xù)培養(yǎng)時都有丙酮酸的分泌,這是由于在氮源限制的連續(xù)培養(yǎng)過程中菌體過量吸收的葡萄糖所致。DH5α的QPyr高于DA19,這與DH5α的QS更高有關(guān)。除此之外,DH5α在MN的連續(xù)培養(yǎng)中還檢測到了乙醇(在MNA中未檢測到乙醇),這在好氧培養(yǎng)過程中是很少見的。雙向電泳顯示,在此培養(yǎng)條件下DH5α中由yahK編碼的依賴于鋅離子與NAD(P)的醇脫氫酶的蛋白量是DA19的7倍左右,在添加乙酸鈉的情況下為3.15倍。該酶具有與adh基因產(chǎn)物類似的功能,即參與NADH的周轉(zhuǎn),同時產(chǎn)生醇類物質(zhì)。Berrios-Rivera等認(rèn)為,即使在有氧條件下,過量的NADH也會激活本來無活性的途徑,使得菌體傾向于形成多消耗NADH的產(chǎn)物,如乙醇。由此推測DH5α胞內(nèi)NADH的水平較高,有限的呼吸鏈容量無法有效地將NADH氧化成NAD+,從而造成了乙醇的產(chǎn)生。DH5α通過產(chǎn)乙酸途徑來為菌體提供能量,表明其TCA循環(huán)或呼吸鏈通量限制,再加上其有乙醇分泌,表明其氧化磷酸化的限制。DA19在相同的條件下則沒有檢測到乙醇的存在,且QAC低,反映了DA19的氧化磷酸化能力高于DH5α。在碳源限制的基本培養(yǎng)基中進行連續(xù)培養(yǎng)時,只有當(dāng)比生長速率超過產(chǎn)乙酸臨界比生長速率時,才會有乙酸產(chǎn)生。張曉云對M培養(yǎng)基(碳源限制)中分批培養(yǎng)的動力學(xué)分析顯示,DA19產(chǎn)乙酸的臨界比生長速率為0.23h-1,而在MN培養(yǎng)基的連續(xù)培養(yǎng)過程中,在比生長速率0.13h-1時就已經(jīng)有乙酸的分泌,這是因為在MN培養(yǎng)基中的QS(3.33mmol·g-1·h-1)比碳源限制分批培養(yǎng)對數(shù)期時的QS(1.33mmol·g-1·h-1)要大得多,因此過量的碳源以乙酸的形式被分泌到胞外。2.2mna和mn培養(yǎng)基中的副產(chǎn)物流動網(wǎng)絡(luò)DA19和DH5α在氮源限制的連續(xù)培養(yǎng)中,穩(wěn)態(tài)代謝流分布見表2。DH5α的酵解途徑(EMP)流量高于相同情況下DA19的EMP流量,但兩者的r2對r1的分流比接近,都在93%左右。兩個菌株P(guān)P途徑的流量很小,且十分接近。這是因為TCA循環(huán)產(chǎn)生的NADPH可以滿足菌體合成的需求,使得PP途徑的功能主要是提供合成菌體前體物質(zhì),而二者比生長速率基本相同的緣故。DH5α中TCA循環(huán)的流量(r8)則低于相同情況下DA19的流量,反映了DA19氧化磷酸化能力的改善。DH5α具有較高的EMP流量和較低的TCA循環(huán)流量,造成乙酸和丙酮酸等副產(chǎn)物的更大流量。在MN和MNA培養(yǎng)基中兩個菌株代謝網(wǎng)絡(luò)中的丙酮酸和乙酰輔酶A節(jié)點流量有較明顯差異,見圖2。DA19在MN培養(yǎng)基中分泌丙酮酸的分流比比DH5α低29%左右,而在MNA培養(yǎng)基中則要低48%。同時,DA19在MN培養(yǎng)基中乙酸的分流比比DH5α低22%,而TCA分流比則要高出22%左右。在MNA培養(yǎng)基中,DA19的乙酸的分流比比DH5α低34%,而TCA則要高出20%。在MN培養(yǎng)基中,DA19的TCA的絕對流量比DH5α提高了將近12%,而在MNA培養(yǎng)基中提高了將近51%。這說明DA19的TCA流量限制小,較有效地將丙酮酸流向TCA循環(huán),減少乙酸的分泌。這些優(yōu)勢在添加乙酸的培養(yǎng)基中更加顯著。根據(jù)代謝流分布結(jié)果,可以計算ATP(取P/O比為2)和二氧化碳的比生成速率QATP、QCO2,以及比耗氧速率QO2,在此基礎(chǔ)上可以計算呼吸熵RQ、菌體的ATP得率YATP和碳回收率,其結(jié)果見表3。兩個菌株的碳回收率都非常接近100%。ATP的產(chǎn)生速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于菌體合成所需的ATP,兩個菌株的YATP很低,僅2～3g·mol-1,遠(yuǎn)低于能量偶合時的10g·mol-1左右。雙向電泳顯示DA19的由atpA編碼的ATP合成酶F1部分α亞基的表達水平顯著高于DH5α,達30倍。由此推測:由于ATP合成酶的限制,DH5α電子傳遞所產(chǎn)生的能量不能有效轉(zhuǎn)化到ATP中,而是以熱量的形式浪費掉。DH5α在MN中的連續(xù)培養(yǎng)還產(chǎn)生了乙醇,這反映了DH5α不能將代謝所產(chǎn)生的NADH完全通過氧化磷酸化途徑周轉(zhuǎn),因此實際QATP很可能遠(yuǎn)低于表3的計算結(jié)果。2.3磷酸戊糖對da19的tca循環(huán)能力的影響DA19和DH5α在相近比生長速率下代謝流分布明顯不同,因此對連續(xù)培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵酶活進行了測定,考察其酶活的變化是否與代謝流分析的結(jié)果一致。酶活測定結(jié)果見圖3。磷酸果糖激酶(PFK)和6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)分別是EMP和PP途徑的限速酶。DA19的磷酸果糖激酶(PFK)酶活僅為DH5α的22%(MN和MNA),與其代謝流r2低的結(jié)果一致。DA19的G6PDH活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DH5α,為3.8倍(MN和MNA),但代謝流(r11)沒有明顯差異。這是由于在同樣的比生長速率下二者合成細(xì)胞所需前體相同,而磷酸戊糖途徑主要起提供前體的作用,NADPH可由TCA循環(huán)提供。異檸檬酸脫氫酶(ICDH)是TCA循環(huán)中的一個酶,DA19的ICDH為DH5α的1.18倍(MN中)和1.43倍(MNA中),這與代謝流分析的結(jié)果一致,反映DA19的TCA循環(huán)能力要高于DH5α。DH5α的ICDH活性在添加乙酸鈉后降低了29%,只有DA19的70%;而DA19的ICDH在添加乙酸鈉后則只降低了14%,表明外源乙酸對DH5α的TCA循環(huán)流量影響要大于DA19。乙酸激酶(ACK)是產(chǎn)乙酸途徑中一個關(guān)鍵酶。在MN培養(yǎng)基中,DA19的ACK酶活為DH5α的60%,乙酸流量相應(yīng)比DH5α降低了約29%。在MNA培養(yǎng)基中,DA19的ACK酶活為DH5α的74%,也與二者的乙酸流量變化趨勢一致。異檸檬酸裂解酶(ICL)是涉及乙酸代謝的一個重要酶,但因葡萄糖對ICL表達存在阻遏作用,測得的ICL活性很低,與Peng等以乙酸為碳源時的0.12μmol·min-1·(mgprotein)-1相比可以忽略不計,這與構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)時的假設(shè)一致。綜上所述,除了6-磷酸葡萄糖脫氫酶以外,酶活與代謝流的差異一致。3發(fā)酵過程中的脂肪酸生成與出發(fā)菌株DH5α相比,乙酸耐受突變株DA19在MN和MNA的連續(xù)培養(yǎng)過程中的葡萄糖比消耗速率降低,乙酸和丙酮酸比生成速率都有所降低,而菌體關(guān)于葡萄糖的得率YX/S提高,其代謝效率要高于DH5α。代謝流和酶活分析結(jié)果都表明:DH5α和DA19在EMP和TCA循環(huán)途徑存在顯著差異。DA19的TCA循環(huán)/電子傳遞鏈的能力提高,從而減少了乙酸等副產(chǎn)物的分泌。這些優(yōu)勢在添加乙酸鈉的MNA培養(yǎng)基中體現(xiàn)得更加明顯。對于DH5α,推測其胞內(nèi)氧化磷酸化通量較低,從而造成胞內(nèi)NADH濃度增高,限制了TCA循環(huán)。大腸桿菌生長快,營養(yǎng)要求簡單,遺傳背景