大鼠糖尿病模型的建立

大鼠糖尿病模型的建立

謝菲諾明斯圖爾特是氨基葡萄糖-亞硝基和dns-烷基化試劑，可選擇性損傷動(dòng)物胰島細(xì)胞?，F(xiàn)在，它是一種廣泛使用的糖尿病動(dòng)物模型化學(xué)誘導(dǎo)劑。大鼠糖尿病模型造模成功的判斷指標(biāo),研究中多采用檢測(cè)血糖、血清胰島素水平、C肽值和口服糖耐量(OGTT)等。為了觀察糖尿病早期的病理變化,同時(shí)也為了給藥物篩選實(shí)驗(yàn)提供早期檢測(cè)參數(shù),本實(shí)驗(yàn)采用不同劑量的STZ來(lái)誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病,研究不同的生化以及病理指標(biāo)在糖尿病發(fā)生早期的變化,篩選和確定糖尿病大鼠成模早期敏感的器官和生化指標(biāo)。1材料和方法1.1stz檸檬酸三鈉5D-2型微量血糖測(cè)定儀(北京怡成生物電子技術(shù)有限公司);JJ2000Y型電子天平(常熟雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng));STZ(Sanland公司產(chǎn)品,批號(hào):s100325);檸檬酸(批號(hào):20090306);檸檬酸三鈉(批號(hào):20080301),分析純(廣州化學(xué)試劑廠(chǎng));INS放免試劑盒(北京科美東雅生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20091225);C肽放免試劑盒(北京科美東雅生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20091225)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±10)g,購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(粵)2003-0001,飼養(yǎng)于廣州解放軍第458醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。采用標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房鼠籠喂養(yǎng),飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,自由飲水。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1尾尖采血實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,飲食正常,體質(zhì)量不減輕,且尾尖采血測(cè)定血糖值正常的大鼠,選用于實(shí)驗(yàn)。造模前1d下午5:00大鼠開(kāi)始禁食不禁水,第2天上午9:0060只大鼠隨機(jī)分成5組,每組12只。1.3.2實(shí)驗(yàn)大鼠stz的造模實(shí)驗(yàn)STZ用檸檬酸鹽緩沖液(0.1mol/L、pH4.5)配成質(zhì)量濃度為5.0mg/mL的溶液,避光冰浴放置備用。各組實(shí)驗(yàn)大鼠按照以下劑量一次性腹腔注射STZ溶液:正常組(檸檬酸鹽緩沖液)、20mg組(STZ20mg/kg)、30mg組(STZ30mg/kg)、50mg組(STZ50mg/kg)和80mg組(STZ80mg/kg)。造模后每天測(cè)量大鼠體質(zhì)量與血糖,血糖值超過(guò)16.7mmol/L的為糖尿病大鼠,實(shí)驗(yàn)觀察期為10d。1.3.3血清中的胰島素和c基因含量1.3.4小鼠肝腎功能異常指標(biāo)量化指標(biāo)造模后第9天大鼠麻醉取血后處死,解剖檢查臟器,分別取心、肝、脾、肺、腎、胰腺、主動(dòng)脈、睪丸和眼球等共9個(gè)臟器,用10%(φ)中性甲醛溶液固定48h后,取材作常規(guī)石蠟包埋切片。用OLYMPUSBX41光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)變化并拍照。用Image-ProExpressC圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行腎小球的平均橫截面積(MGA)、腎小球平均體積(MGV)及胰島細(xì)胞數(shù)目等定量指標(biāo)分析。腎小球平均橫截面積(MGA):每張切片隨機(jī)測(cè)量20個(gè)腎小球的橫截面積,取均值;腎小球平均體積(MGV)根據(jù)公式MGV=1.5×MGA3/2;胰島數(shù)目:每張切片計(jì)算5個(gè)視野中胰島的總和。眼球病理改變分類(lèi):(–):無(wú)明顯病理學(xué)改變;(+):晶狀體上皮細(xì)胞排列不規(guī)則,部分細(xì)胞呈空泡樣變性,局部見(jiàn)復(fù)層排列,晶狀體纖維排列整齊;(++):晶狀體上皮細(xì)胞排列不規(guī)則,部分細(xì)胞呈空泡樣變性,淺層皮質(zhì)的晶狀體纖維腫脹,排列紊亂,紋理不清;(+++):晶狀體上皮細(xì)胞排列不規(guī)則,局部細(xì)胞遺留空泡樣輪廓,細(xì)胞核消失。大部分晶狀體纖維腫脹,排列紊亂,紋理不清,可見(jiàn)大小不等的球樣Morgagnian小體。1.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1成模率及死亡率實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),20mg組無(wú)大鼠的血糖值超過(guò)16.7mmol/L,也無(wú)大鼠死亡,成模率與死亡率都為0;30mg組成模率為16.7%,死亡率為0;50mg組的成模率為91.7%,死亡率為0;80mg組的成模率為58.3%,死亡率為33.4%,見(jiàn)表1。2.2空腹血糖和隨機(jī)血糖從造模開(kāi)始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,正常對(duì)照組、20mg組、30mg組和50mg組的大鼠平均體質(zhì)量,與實(shí)驗(yàn)前相比,分別增加27.5g、27.9g、17.9g和10.9g,而80mg組的大鼠平均體質(zhì)量下降了23g,見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,20mg組大鼠空腹及隨機(jī)血糖一直沒(méi)有升高,維持在正常的血糖值范圍內(nèi)(<6mmol/L);30mg組大鼠空腹血糖一直維持在正常范圍內(nèi)(<6mmol/L),隨機(jī)血糖值在造模后第2天開(kāi)始升高,第4天后開(kāi)始下降,5d后大部分大鼠血糖值下降到正常范圍值內(nèi),只有2只大鼠的血糖值超過(guò)了16.7mmol/L;造模后第3天,50mg組個(gè)別大鼠空腹血糖小幅度升高,到實(shí)驗(yàn)結(jié)束約有90%大鼠空腹血糖值超過(guò)16.7mmol/L,而隨機(jī)血糖大部分都超過(guò)了16.7mmol/L。80mg組的大鼠從造模開(kāi)始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,空腹及隨機(jī)血糖值一直維持在高位,血糖值都超過(guò)16.7mmol/L(圖2)。2.3兩組c肽含量比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)80mg組大鼠血清胰島素含量大幅下降,與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),C肽含量與正常組比較顯著下降(P<0.05),見(jiàn)表2。2.4stz對(duì)大鼠、胰腺、眼睛、心臟、肝臟、脾臟、肺、動(dòng)脈和睪丸的影響2.4.1腎血管基質(zhì)病變50mg和80mg組的腎臟質(zhì)量明顯增加,與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。30mg、50mg和80mg組的腎小球血管基質(zhì)增生、腎小管水樣變性較多,無(wú)腎臟壞死的現(xiàn)象,見(jiàn)表3、圖3A。正常組與80mg、50mg、30mg組比較,MGA、MGV值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見(jiàn)表4。2.4.2大鼠胰島計(jì)數(shù)30mg、50mg和80mg組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),部分大鼠出現(xiàn)胰島細(xì)胞變性、壞死的情況,胰島數(shù)量大幅減少,30mg、50mg和80mg組胰島總數(shù)與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表5、圖3B。2.4.3視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及組織形態(tài)觀察正常組大鼠眼球角膜結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)缺損,視網(wǎng)膜各層排列有序,連接緊密,未見(jiàn)剝離現(xiàn)象,血管未見(jiàn)擴(kuò)張或狹窄;局部晶狀體上皮呈復(fù)層排列,晶狀體纖維排列整齊。20、30、50、80mg組大鼠眼球角膜結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)缺損,視網(wǎng)膜各層排列有序,連接緊密,未見(jiàn)剝離現(xiàn)象,血管未見(jiàn)擴(kuò)張或狹窄。20mg組大鼠(2/12)、30mg組大鼠(3/12)、50mg組大鼠(4/11)、80mg組大鼠(5/7)出現(xiàn)局部晶狀體上皮呈復(fù)層排列,纖維排列紊亂。80mg組大鼠(2/7)出現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞排列不規(guī)則,部分細(xì)胞呈空泡樣變性,淺層皮質(zhì)的晶狀體纖維腫脹,排列紊亂,紋理不清。見(jiàn)表6、圖3C。2.4.4不同劑量的stz對(duì)糖尿病大鼠的心臟、肺、肝臟、脾臟、動(dòng)脈和睪丸的影響各組大鼠心臟、肺、肝臟、脾臟、主動(dòng)脈和睪丸均無(wú)病理性變化。3不同stz劑量對(duì)大鼠血糖的影響STZ是由無(wú)色素原鏈霉菌屬產(chǎn)生的一種廣譜抗生素,具有抗腫瘤的作用及致糖尿病的副作用。其引起糖尿病的機(jī)制主要有以下幾種:(1)STZ直接經(jīng)由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2(GLUT2)進(jìn)入胰島β細(xì)胞,使DNA烷基化,造成DNA損傷,進(jìn)而誘發(fā)多聚ADP核糖基化作用,耗竭胰島β細(xì)胞內(nèi)NAD+和ATP含量,最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞壞死。(2)通過(guò)氧化亞氮(NO)和自由基2種途徑損傷胰島β細(xì)胞DNA,并進(jìn)一步誘導(dǎo)多聚ADP核糖基化作用,導(dǎo)致胰島β細(xì)胞大量壞死。(3)STZ損傷胰島β細(xì)胞后,激活自身免疫過(guò)程,累及胰島β細(xì)胞的生存。由于采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型具有成模快速、穩(wěn)定、高血糖維持時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),目前已成為廣泛采用的糖尿病動(dòng)物模型化學(xué)誘導(dǎo)劑。1型糖尿病造模一般選用的動(dòng)物是SD大鼠或Wistar大鼠,造模所用的STZ劑量從40~80mg/kg不等。當(dāng)空腹大鼠經(jīng)腹腔或靜脈注射了STZ后,大鼠可表現(xiàn)為高血糖、多飲、多食、多尿和體質(zhì)量減輕等典型糖尿病癥狀。研究顯示,血糖的變化與STZ劑量有明顯的相關(guān)關(guān)系,劑量過(guò)低,不足以造成胰島細(xì)胞的顯著破壞引起高血糖,只有胰島細(xì)胞大量損傷時(shí),才會(huì)導(dǎo)致高糖血癥;而劑量過(guò)大,則會(huì)導(dǎo)致造模動(dòng)物急性死亡。本實(shí)驗(yàn)采用了20、30、50、80mg/kg劑量的STZ,研究誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型所需的STZ劑量。從注射STZ24h后開(kāi)始監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠各項(xiàng)生理指標(biāo)。其中20mg組大鼠各生化指標(biāo)無(wú)明顯變化,血糖維持在正常值范圍內(nèi),多個(gè)器官病理檢查未發(fā)現(xiàn)異常情況,說(shuō)明該劑量的STZ不能誘導(dǎo)SD大鼠出現(xiàn)糖尿病;30mg組進(jìn)食、飲水正常,空腹血糖正常,隨機(jī)血糖出現(xiàn)波動(dòng),從造模后第3天開(kāi)始升高,第5天開(kāi)始下降,病理檢查發(fā)現(xiàn)這些大鼠腎臟及眼球都出現(xiàn)輕微的病變,胰島數(shù)量減少,說(shuō)明30mg劑量的STZ已經(jīng)能夠輕微損傷大鼠的胰島,該組大鼠的隨機(jī)血糖從升高到恢復(fù)正常,可能與大鼠胰腺的代償作用有關(guān);50mg組大部分大鼠出現(xiàn)“三多”現(xiàn)象,空腹與隨機(jī)血糖明顯升高,胰腺、腎臟和眼球都出現(xiàn)了較嚴(yán)重的損傷,胰島數(shù)量明顯減少,說(shuō)明該組大鼠的胰島細(xì)胞損傷較嚴(yán)重,胰腺自身的代償作用已不能維持大鼠的生理血糖水平,到造模后第9天隨機(jī)血糖和空腹血糖都持續(xù)升高;80mg組大鼠出現(xiàn)典型的1型糖尿病“三多一少”現(xiàn)象,體型消瘦,體質(zhì)量下降,眼球、腎臟以及胰腺病變嚴(yán)重,胰島數(shù)量比正常組大鼠減少了1/3,個(gè)別大鼠死亡。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在STZ造模的早期,不同STZ劑量組血糖存在明顯不同的動(dòng)態(tài)變化。正常組與20mg組的空腹血糖和隨機(jī)血糖始終都趨于正常;30mg組的隨機(jī)血糖在第3~5天左右略有升高;50mg組隨機(jī)血糖從造模之初就開(kāi)始顯著升高,但空腹血糖卻在1周之后才開(kāi)始顯著升高;80mg組,無(wú)論隨機(jī)血糖還是空腹血糖,從造模之初就開(kāi)始顯著升高。由此可見(jiàn),用STZ進(jìn)行糖