莫諾苷對sz誘導糖尿病腎病小鼠的保護機制

莫諾苷對sz誘導糖尿病腎病小鼠的保護機制

糖尿?。╠n）是糖尿病最常見、最難治療的微血管并發(fā)癥之一。發(fā)病率為30%40%，這可以增加心血管事件的發(fā)生率和死亡率。DN病理過程為腎小球肥大、細胞外基質(zhì)(ECM)增多和腎小球硬化,腎小球高濾過和蛋白尿,最后發(fā)展為慢性腎功能不全、腎纖維化和終末期腎衰。糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是導致DN的主要原因。研究發(fā)現(xiàn),長期高血糖可促使體內(nèi)還原糖與蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化反應,形成AGEs。糖尿病患者食用富含AGEs的食物可加速DN的進程。中醫(yī)藥在DN的治療中具有悠久歷史及顯著療效。前期研究發(fā)現(xiàn),山茱萸環(huán)烯醚萜苷類成分在抑制和裂解AGEs方面作用較優(yōu);山茱萸環(huán)烯醚萜苷類代表成分莫諾苷(莫羅忍冬苷)在細胞保護方面作用較突出;莫諾苷是其主要效應成分,可顯著降低血糖、清除血清AGEs及降低尿蛋白水平。在此基礎上,本實驗采用高AGEs飼料加重鏈脲佐菌素(STZ)誘導的DN小鼠模型,探究山茱萸環(huán)烯醚萜苷類代表成分莫諾苷的效應機制,為山茱萸治療DN提供參考和依據(jù)。1材料表面1.1動物、飼料和高年齡s飼料SPF級雄性C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量18~22g,蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司,動物許可證號SCXK(蘇)2009-0001;AIN-93G飼料、高AGEs飼料由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。小鼠飼養(yǎng)于層流架中,室溫保持在20~25℃,濕度55%左右,動物自由進食、進水,每天保持12h的晝夜循環(huán)。1.2免疫酶及生化藥物檢測STZ(批號101025)、鹽酸氨基胍(批號MW09081),Sigma公司;鹽酸二甲雙胍片(批號120309),北京京豐制藥有限公司;卡托普利片(批號12020611),常州制藥廠有限公司;莫諾苷(質(zhì)量分數(shù)98%),由江蘇大學楊歡副教授提供。尿蛋白、血清肌酐測定試劑盒,血清尿素氮測定試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所;血清胰島素酶聯(lián)免疫測定試劑盒及小鼠血清AGEs酶聯(lián)免疫測定試劑盒,美國BD公司分裝;RT-PCR反應試劑盒,寶生物有限公司(大連);組織蛋白提取試劑盒,南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒,碧云天生物技術研究所;兔抗鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)一抗,CST公司;兔抗鼠NADPH、羊抗兔辣根過氧化酶標記二抗,Bioworld公司。小鼠β-actin引物,上游5’-AGGGAAATCGTGCGTGACTTCA-3’,下游5’-CCCAAGAAGGAAGGCTGGAAA-3’;小鼠RAGE引物,上游5’-CTGAGACGGGACTCTTTAC-ACTGC-3’,下游5’-TATTCCACCTTCAGGCT-CAACCA-3’,以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。1.3電子顯微鏡Direct—Q超純水儀,美國MILLIPORE公司;ACCU—CHEK血糖儀,美國羅氏公司;SynergyHT酶標儀,美國BioTeK公司;COUVTER高速冷凍離心機,美國BECKMAN公司;JEM—1011電子顯微鏡,日本JEOL公司;MastercyclergradientPCR儀,Eppendorf公司;Tanon4200凝膠成像系統(tǒng)、HE—120水平電泳槽,上海天能科技有限公司;Power—pacBasic/Power—pac200電泳儀、MimiProtean垂直電泳槽、SEM1—DRY半干轉膜儀,美國伯樂公司;LAS4000mini超靈敏化學發(fā)光儀,美國GE公司;XZH/1105/ABD—NZY蛋白核酸分析儀,德國Eppendorf;IKAT18basic勻漿器,德國ULTRA-TURRAX公司。2方法2.1糖尿病模型小鼠的檢測取雄性健康小鼠,經(jīng)適應性喂養(yǎng),分別在第1、4天ipSTZ(100mg/kg),第8天測定空腹血糖,取空腹血糖值>15mmol/L的小鼠作為糖尿病模型小鼠。2.2模型小鼠飼飼數(shù)據(jù)模型采用卡托普利組,將莫諾苷低、高劑量0.將糖尿病小鼠隨機分為模型組,氨基胍組(0.1g/kg),二甲雙胍組(0.2g/kg),卡托普利組(0.02g/kg),莫諾苷低、高劑量(0.02、0.10g/kg)組,每組10只。另取10只正常小鼠設為對照組,對照組小鼠喂飼普通飼料,其余各組喂飼高AGEs飼料;各組ig給予相應劑量的藥物12周,對照組與模型組ig等量蒸餾水。2.3臟器病理組織學檢測在給藥第4、8、12周末測定各組小鼠24h尿蛋白(2只小鼠放在一個代謝籠中,收集尿樣)、空腹血糖;在12周末將小鼠禁食12h,眼眶取血,測定各組小鼠血清胰島素水平、血清尿素氮及肌酐水平、血清AGEs水平;將小鼠胰腺切片經(jīng)HE染色后置光學顯微鏡(×100)觀察其主要病變;取兩側腎臟稱質(zhì)量并計算腎臟系數(shù)(腎臟系數(shù)=腎臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100);取左側腎臟用于觀察腎小球內(nèi)皮細胞、系膜細胞、足細胞結構變化,以及經(jīng)組織勻漿、離心后取上清液用ELISA法測腎臟組織AGEs水平,其余經(jīng)切片、HE染色后光學顯微鏡(×400)觀察主要病變;取右腎腎皮質(zhì)用RT-PCR法測RAGEmRNA以及Westernblotting法測RAGE蛋白表達水平。2.4rt-pcr顯示腎組織的ragem輪廓公式2.4.1變性、退火反應滅菌無酶EP管中依次加入腎皮質(zhì)組織提取物總RNA、OligodTPrimer(2.5μmol/L)、dNTPMixture(10mmol/L)RNaseFreedH2O,65℃5min、4℃保存進行變性、退火反應;在滅菌無酶EP管中依次加入上述反應液、5×PrimeScript緩沖液、PrimeScriptRtase、RnaseInhibitor(40U/μL)、RNaseFreedH2O,30℃、10min,42℃、30min,95℃、5min進行逆轉錄。2.5pvdf膜的制備提取腎內(nèi)皮組織蛋白,并用BCA法進行蛋白定量。電泳條件為5%濃縮膠恒壓80V約30min,10%分離膠120V約80min。半干法將凝膠轉移到PVDF膜上,按約0.1mL/cm2量加入封閉液和適量一抗相應抗體(4℃,過夜)。PBST漂洗濾膜3次,每次10min。辣根過氧化酶標記的二抗(1∶5000)室溫下?lián)u蕩孵育1~2h,然后用PBST充分洗膜,漂洗3次,每次10min。按0.1mL/cm2顯影液計算用量,將顯影液加于PVDF膜上。凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并用圖像分析軟件進行分析。2.6統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)以ue0af±s表示,數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計處理,組間比較方差齊性采用t檢驗,方差不齊者采用非參數(shù)檢驗。3結果3.1小鼠血糖變化模型組小鼠血糖明顯升高,與對照組比較差異顯著(P<0.01);第4周開始,各給藥組小鼠血糖下降;二甲雙胍組血糖下降明顯,與模型組比較差異顯著(P<0.05);第12周末,氨基胍、莫諾苷高劑量組小鼠血糖下降明顯,與模型組比較差異顯著(P<0.05、0.01)。見表1。模型組小鼠血清胰島素水平下降,與對照組比較差異顯著(P<0.01);各給藥組小鼠血清胰島素水平升高,除莫諾苷低劑量組外,與模型組比較差異均顯著(P<0.01)。見表2。與對照組比較,模型組小鼠胰島病變,局部腺泡細胞空泡變性,胰島形態(tài)不規(guī)則、分布不均勻、排列紊亂,胰島細胞變性、減少;各給藥組病變得到改善。見表2和圖1。3.2各組小鼠血清尿素氮、尿胱素氮水平比較模型組小鼠24h尿蛋白增加,與對照組比較差異顯著(P<0.01);各給藥組小鼠24h尿蛋白降低,與模型組比較差異顯著(P<0.01),見表3。模型組小鼠血清肌酐、尿素氮水平增加,與對照組比較差異顯著(P<0.01);各給藥組小鼠血清肌酐、尿素氮明顯降低;氨基胍、二甲雙胍、莫諾苷高劑量組小鼠血清肌酐水平與模型組比較差異顯著(P<0.01);莫諾苷高劑量組小鼠血清尿素氮與模型組比較差異顯著(P<0.01),見表3。3.3影響dn大鼠腎臟病理改變的影響3.3.1各組肝腎組織病理學比較模型組小鼠腎臟明顯肥大,與對照組比較差異顯著(P<0.01);除卡托普利組外各給藥組腎臟變小;氨基胍和莫諾苷高、低劑量組與模型組比較差異顯著(P<0.01)。見表4。3.3.2莫諾苷高劑量組pf模型組腎小球系膜基質(zhì)增多,系膜區(qū)基質(zhì)增寬,腎小管上皮細胞空泡變;各給藥組病變程度減輕;莫諾苷高劑量組與模型組比較差異顯著(P<0.05)。見表4和圖2。3.4各組細胞增殖及細胞畸變透射電鏡觀察結果表明,模型組小鼠腎皮質(zhì)內(nèi)皮細胞增生,細胞腫脹,細胞核核形不規(guī)則,基底膜增厚,血管腔狹窄,染色質(zhì)濃聚;各給藥組病變減輕,見圖3。模型組系膜細胞增生,系膜基質(zhì)增生,細胞腫脹,部分細胞出現(xiàn)脂褐素沉積,細胞核核形不規(guī)則,個別線粒體變性及染色質(zhì)濃聚;各給藥組病變減輕,見圖4。模型組足細胞變性壞死,細胞膜不完整,胞漿溶解,足突明顯融合伴有微絨毛化(蛋白丟失),部分細胞出現(xiàn)脂褐素沉積,細胞核核形不規(guī)則,個別線粒體變性及染色質(zhì)濃聚;各給藥組病變減輕,見圖5。3.5各組小鼠血清、臟器臟器效能比較模型組血清、腎臟AGEs水平與對照組比較顯著升高(P<0.01);各給藥組血清、腎臟AGEs水平降低;除卡托普利組外,各給藥組與模型組比較差異顯著(P<0.05、0.01);氨基胍作用最強,其次為莫諾苷。見表5。3.6各組ragemrna表達比較模型組腎皮質(zhì)RAGEmRNA表達增加;與模型組比較,氨基胍、莫諾苷高劑量組RAGEmRNA表達下調(diào)明顯(P<0.05、0.01),其余各組均下調(diào),但差異不顯著,見圖6。3.7各組rage蛋白表達水平比較模型組腎皮質(zhì)RAGE蛋白表達增加;與模型組比較,氨基胍、二甲雙胍、莫諾苷高劑量組RAGE蛋白表達下調(diào)明顯(P<0.05),其余各組均下調(diào),但差異不顯著,見圖7。4中藥作用機制現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)DN患者腎小球濾過率發(fā)生病變,易導致蛋白尿、尿肌酐和血清尿素氮水平升高。DN早期主要能夠檢測到尿微量白蛋白,而臨床上將持續(xù)性蛋白尿作為判斷DN的標準。DN的病理特征是腎小球系膜細胞增殖、基底膜增厚等。研究發(fā)現(xiàn),大部分腎臟血管、組織結構中都易發(fā)生AGEs的沉積,如內(nèi)皮細胞、系膜細胞、足細胞以及腎小管上皮細胞。AGEs可促使單核-巨噬細胞、系膜細胞等分泌炎癥因子,導致腎小球細胞增殖、基底膜增厚、尿蛋白增多;捕捉低密度脂蛋白引起內(nèi)皮細胞和系膜細胞損傷、腎小球硬化。中藥在防治DN方面具有療效顯著、毒副作用小等優(yōu)勢?，F(xiàn)代研究證實山茱萸能在體內(nèi)或體外抑制AGEs的形成;其主要作用部位是環(huán)烯醚萜苷類,可降低糖尿病大鼠尿微量白蛋白,保護AGEs致系膜細胞的損傷。本實驗結果表明,對于AGEs加重STZ致DN的小鼠,莫諾苷可改善其“三多一少”癥狀,降低血糖,保護胰島細胞,減少尿蛋白,降低血清尿素氮,防止內(nèi)皮細胞、系膜細胞、足細胞增生變性,改善糖原空泡變,減少系膜增生、足突融合、線粒體腫脹,從而緩解DN的發(fā)生、發(fā)展。其保護腎臟的作用可能與降低血清、腎臟AGEs水平,下調(diào)腎皮質(zhì)RAGEmRNA、RAGE蛋白的表達有關。此外本實驗采用的3個陽性藥對DN也有一定的改善作用,其中AGEs抑制劑氨基胍能降低小鼠血清及腎臟中AGEs水平;二甲雙胍有較好的降血糖作用;卡托普利臨床上可治療高血壓伴隨DN,限制胰島素在代謝活躍組織的轉運,減少肝臟對胰島素的降解。通過進行平行實驗,充分驗證了莫諾苷改善DN的優(yōu)良功效。為了深入探討莫諾苷治療DN作用機制,還需要運用基因過表達、沉默等技術對AG