生防放線菌167固態(tài)發(fā)酵條件及耐熱力評(píng)價(jià)

生防放線菌167固態(tài)發(fā)酵條件及耐熱力評(píng)價(jià)

生防放線菌153的抗菌譜廣泛，適應(yīng)性強(qiáng)。它對(duì)梨屬株、紅景天、裸頭菌和其他致病性有顯著的可持續(xù)抑制，并可以在各種主要癥狀的根、莖、水果等部位定位。將放線菌制成活體菌劑用于生物防治具有作用持久、環(huán)保安全、可維護(hù)生物多樣性等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),是今后生防領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)。然而國(guó)內(nèi)外對(duì)放線菌活體菌劑的研究報(bào)道較少,菌株的培養(yǎng)方式和有效載體的篩選是制約活體菌劑發(fā)展的重要因素。為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用生防放線菌153,本研究以發(fā)酵物含菌量為篩選指標(biāo),采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化其固態(tài)培養(yǎng)基配方,并考察了菌株的耐熱力,以期為放線菌活體菌劑的研制提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。1材料和方法1.1試驗(yàn)中的蘑菇生防放線菌153,由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室提供。1.2發(fā)酵培養(yǎng)基1.2.1kh2po蛋白表達(dá)改良SNB發(fā)酵液(蔗糖15g/L,甘油15g/L,蛋白胨40g/L,KH2PO40.5g/L,CaCO30.5g/L,NaCl0.5g/L,MgSO40.5g/L)。1.2.2菌株篩選、碳氮源檢測(cè)以麥麩為基本基質(zhì),添加不同的碳源(玉米粉、甘油、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉)和氮源(小米粉、蛋白胨、酵母浸粉、黃豆粉和尿素),以麥麩培養(yǎng)基作為對(duì)照,以含菌量為測(cè)定指標(biāo),篩選對(duì)菌株153產(chǎn)孢有促進(jìn)作用的碳、氮源。在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用L25(56)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化固態(tài)培養(yǎng)基,并設(shè)置誤差項(xiàng),檢測(cè)方案的可信度。正交試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。1.3種子液培養(yǎng)與含菌量的確定將28℃培養(yǎng)7d的生防放線菌153菌種制成106mL-1的菌懸液。取2mL菌懸液接種于100mL改良SNB發(fā)酵液中,于28℃、130r/min振蕩培養(yǎng)96h,培養(yǎng)物即為接種固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行碳、氮源篩選的種子液。(1)發(fā)酵終點(diǎn)的確定。將搖床培養(yǎng)3d的種子液以20%(每100g固態(tài)培養(yǎng)基接種20mL種子液)的接種量接種于優(yōu)化固態(tài)培養(yǎng)基上,并分裝于器皿中,設(shè)3次重復(fù),28℃靜置培養(yǎng),每24h取樣1次,培養(yǎng)9d后取出發(fā)酵產(chǎn)物,自然風(fēng)干,粉碎成菌粉,測(cè)定含菌量;同時(shí),稱取一定質(zhì)量的發(fā)酵物,于105℃烘干至恒質(zhì)量,測(cè)定含水量,確定發(fā)酵終點(diǎn)。(2)種子液接種量的確定。取培養(yǎng)3d的種子液,以5%,10%,15%,20%,25%和30%的接種量接種于固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)9d后測(cè)定固態(tài)發(fā)酵物的含菌量。(3)種子液種齡的確定。分別取搖床培養(yǎng)60,72,84,96,108和120h種齡的種子液,以20%的接種量接種于固態(tài)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)9d后測(cè)定固態(tài)發(fā)酵物的含菌量。將固態(tài)發(fā)酵菌粉和種子液干燥物于55℃水浴,每隔20min取樣1次,測(cè)定含菌量,確定存活率為50%的時(shí)間(致死中時(shí))。以殼聚糖、高嶺土、幾丁質(zhì)、爐渣、碳酸鈣、面粉和非耕作層黃土7種材料為載體,將其與菌粉按質(zhì)量比1∶1混合,55℃水浴至致死中時(shí),以不加載體的菌粉為對(duì)照,測(cè)定含菌量,比較各處理的耐熱力(耐熱力用經(jīng)致死中時(shí)熱處理后的菌體存活率表示)。將篩選出的載體與菌粉等量混合,測(cè)定常溫貯存120d的菌體存活率。菌株153固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化、菌株生長(zhǎng)曲線、耐熱力和常溫貯存期含菌量均采用稀釋平板法測(cè)定,含菌量用lgCFU表示。1.4處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)采用DPS8.01分析;用EXCEL2003制圖。2結(jié)果與分析2.1生防菌15的固體培養(yǎng)基由表2可見(jiàn),在碳源中,玉米粉對(duì)菌株153固態(tài)培養(yǎng)的促進(jìn)作用最好,其含菌量較對(duì)照增加了1.6%,極顯著高于其他處理;添加碳源處理的效果均比對(duì)照好,這說(shuō)明純麥麩的營(yíng)養(yǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足菌株的生長(zhǎng)。在氮源中,添加小米粉的培養(yǎng)基對(duì)菌株153的培養(yǎng)效果最好,其含菌量極顯著高于其他氮源處理;添加尿素后,菌株153生長(zhǎng)被抑制,培養(yǎng)的菌絲較稀疏。綜合分析認(rèn)為,玉米粉和小米粉對(duì)菌株153固態(tài)培養(yǎng)的促進(jìn)作用最為突出,由于它們都是農(nóng)產(chǎn)品,在提供足夠的碳、氮源的同時(shí),還能補(bǔ)充其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如氨基酸、胡蘿卜素、脂肪等,這些物質(zhì)可能調(diào)節(jié)了菌株的生理活動(dòng),刺激了菌株的生長(zhǎng)。由表3可知,各因素對(duì)生防菌153發(fā)酵產(chǎn)物含菌量影響的大小順序依次為:A>E>D>B>C;A、E在測(cè)定的范圍內(nèi)對(duì)菌株153的固態(tài)培養(yǎng)效果影響顯著,表明培養(yǎng)基中的碳源和初始含水量主導(dǎo)著菌株153在固態(tài)條件下的生長(zhǎng)產(chǎn)孢能力。幾個(gè)組合中,以A2B1D1E2和A2B2D1E2組合最優(yōu)。對(duì)2個(gè)最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),所得結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn),兩最優(yōu)組合間無(wú)顯著差異,但從節(jié)約成本方面考慮,確定生防菌153的最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為A2B1D1E2,即80mg/g麥麩,8mg/g玉米粉,10mg/g小米粉和2mg/g蛋白胨,初始含水量(含0.5g/L石灰的自來(lái)水)為60%。在此條件下培養(yǎng),發(fā)酵產(chǎn)物的含菌量較對(duì)照增加了94.1%。2.2153體生防劑的優(yōu)化2.2.1生防放線菌的生長(zhǎng)由圖1可以看出,生防放線菌153需要48h左右的適應(yīng)期以調(diào)節(jié)自身的存在狀態(tài),在培養(yǎng)96h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在216h時(shí)發(fā)酵物含菌量達(dá)到最大,因而確定生防放線菌153的發(fā)酵終點(diǎn)為216h。含水量48%～35%的時(shí)期是固態(tài)發(fā)酵的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,即菌絲生長(zhǎng)活躍的階段,說(shuō)明合適的含水量有利于菌絲在基質(zhì)內(nèi)外的擴(kuò)展;含水量小于35%的階段是孢子大量產(chǎn)生的時(shí)期,即較干燥的環(huán)境宜于孢子的繁殖。這和吳振強(qiáng)等的結(jié)論類(lèi)似。2.2.2接種量對(duì)生防放線菌生長(zhǎng)的影響確定種子液接種量及種齡的研究結(jié)果見(jiàn)表5。表5表明,種子液可在短時(shí)間內(nèi)提供大量接種體,能夠促進(jìn)菌株的固態(tài)發(fā)酵;20%的接種量最適合于生防放線菌153的固態(tài)發(fā)酵,接種量過(guò)低或過(guò)高均不利于固體培養(yǎng),接種量為5%和10%時(shí),生防放線菌153在固體基質(zhì)上生長(zhǎng)緩慢,不能深入基質(zhì)內(nèi)部,容易被雜菌污染,而接種量高于20%時(shí),基質(zhì)水分過(guò)多,嚴(yán)重阻礙了菌株的生長(zhǎng);培養(yǎng)84h的種子液接種效果最好,發(fā)酵物含菌量最大,這和姚偉芳等的結(jié)論一致,說(shuō)明此階段的菌體生命力旺盛,能迅速適應(yīng)基質(zhì)的固態(tài)環(huán)境。2.3153個(gè)放線菌的耐熱性確定2.3.1溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響從圖2可以看出,在55℃條件下,固體發(fā)酵菌粉的含菌量在30min后急劇下降,60min后迅速增加,100min時(shí)達(dá)到最大值,之后逐漸降低。這可能是由于隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),含水量逐漸降低,菌粉孢子在高溫和濕度相互作用下有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程,100min后,溫度對(duì)菌體產(chǎn)生損害作用,含菌量逐漸減少;種子液干燥物對(duì)高溫十分敏感,在處理期間菌量出現(xiàn)了多次波動(dòng),這說(shuō)明經(jīng)固態(tài)發(fā)酵的153菌體對(duì)高溫有較強(qiáng)的適應(yīng)性。對(duì)固體發(fā)酵菌粉在120min后的耐熱力進(jìn)行回歸分析,可得到發(fā)酵物含菌量(y)與熱處理時(shí)間(x)間的模擬方程為:y=0.0002x2-0.0787x+14.911(r=0.999**),進(jìn)而可求得在55℃條件下,菌株153的致死中時(shí)間為136min。2.3.2不同載體的殼聚糖涂膜對(duì)放線菌的影響表6表明,載體對(duì)生防放線菌153的耐熱力和貯存穩(wěn)定性有明顯的影響。經(jīng)55℃熱處理136min后,殼聚糖對(duì)放線菌153孢子的保護(hù)作用最好,菌株耐熱力顯著高于非耕作層黃土,極顯著高于其他載體和對(duì)照;經(jīng)120d貯存后發(fā)酵物菌體存活率較對(duì)照下降了25.5%;非耕作層黃土的耐熱力也顯著高于不加任何載體的菌粉;面粉、高嶺土、爐渣、碳酸鈣和幾丁質(zhì)等載體加劇了孢子的衰亡,導(dǎo)致菌株耐熱力的下降。因此,殼聚糖和非耕作層黃土可作為放線菌153的載體。貯存存活率檢測(cè)結(jié)果表明,各處理經(jīng)長(zhǎng)期貯存后的存活率與55℃的耐熱力有關(guān),兩者之間存在顯著的正相關(guān)性(r=0.908)。這說(shuō)明菌株的耐熱力可間接體現(xiàn)出載體在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)對(duì)菌株的保護(hù)作用。3殼聚糖的含量及使用問(wèn)題固態(tài)發(fā)酵是微生物常用的培養(yǎng)工藝,操作簡(jiǎn)便,產(chǎn)孢量大,培養(yǎng)物便于存儲(chǔ)、運(yùn)輸和田間應(yīng)用。合適的固態(tài)培養(yǎng)基是菌株高效發(fā)酵的基礎(chǔ),影響著生防菌的開(kāi)發(fā)與利用。麥麩培養(yǎng)基通氣性好、成本低廉,但其保水能力差,營(yíng)養(yǎng)單一,產(chǎn)孢量低。本研究在麥麩中添加適量的玉米粉和小米粉分別作為碳源和氮源,優(yōu)化了固態(tài)培養(yǎng)基,不僅極大地促進(jìn)了菌株153的產(chǎn)孢量,而且改良了菌體的生理狀態(tài)。適宜的載體可有效地增加菌劑的穩(wěn)定性,但載體的篩選是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的工作。本研究以菌株耐熱力作為篩選菌劑載體的指標(biāo),利用該指標(biāo)縮短了生防放線菌153載體的篩選周期,可作為研制菌劑的輔助手段,這為菌劑的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。殼聚糖具有優(yōu)良的生物降解性和生物親和性,易成膜,產(chǎn)生的膜具有良好的黏著性、通透性和抗拉強(qiáng)度。本試驗(yàn)結(jié)果表明,殼聚