sz誘導(dǎo)法優(yōu)化糖尿病小鼠模型的研究

sz誘導(dǎo)法優(yōu)化糖尿病小鼠模型的研究

streptonozerin是一種光譜抗生素，具有抗菌和腫瘤的性能，以及糖尿病的作用。該藥對(duì)動(dòng)物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的毒性作用,能誘發(fā)許多動(dòng)物產(chǎn)生糖尿病,因其操作簡(jiǎn)單、成?？?、對(duì)機(jī)體組織毒性相對(duì)較小、動(dòng)物存活率高、造模長期穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于制備糖尿病動(dòng)物模型。目前的文獻(xiàn)報(bào)道中,由于動(dòng)物的品種、年齡、給藥方式和劑量、給藥途徑、是否空腹以及是否使用高糖高脂飼料等許多方面因素不同,STZ的藥物使用和管理差異懸殊。有一次性給藥方法,也有連續(xù)多次給藥方法,使用的藥物劑量也從20mg/kg至240mg/kg不等,得到的模型的血糖水平以及血糖維持時(shí)間也有差距。目前關(guān)于糖尿病小鼠模型的藥物誘導(dǎo)方案,已有許多文獻(xiàn)報(bào)道,但由于研究目的和方法的不同,STZ誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型并沒有一個(gè)廣泛認(rèn)同的標(biāo)準(zhǔn)方案,尤其是目前的糖尿病模型研究多以近期(4周)為研究終點(diǎn),模型動(dòng)物多用大鼠,對(duì)如何建立一個(gè)長期而穩(wěn)定的糖尿病小鼠模型的研究還很少,但這對(duì)于研究糖尿病慢性并發(fā)癥非常關(guān)鍵。因而,為了得到一個(gè)較穩(wěn)定、維持時(shí)間較長的糖尿病小鼠模型,筆者對(duì)STZ的給藥方案進(jìn)行了探索和優(yōu)化。1材料和方法1.1動(dòng)物中心飼養(yǎng)SPF級(jí)8~10周C57BL/6J雌性小鼠60只,體重19~21g,購于中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,在中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的屏障環(huán)境中飼養(yǎng),使用普通小鼠飼料(非高脂高糖飼料),小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境濕度保持在50%~70%,溫度保持在20~24℃,每天保持12h的晝夜循環(huán)。所有有關(guān)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)過程均在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的監(jiān)督、指導(dǎo)下完成,符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。1.2快速血糖儀及血糖體驗(yàn)STZ購自Sigma公司,檸檬酸三鈉和檸檬酸購自廣州化學(xué)試劑廠,快速血糖儀及血糖試紙(穩(wěn)豪)購自強(qiáng)生公司。STZ溶液的配置:用滅菌0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH=4.5)溶解STZ粉劑,制成1%STZ液,現(xiàn)配現(xiàn)用。1.3stz分次注射治療將60只C57BL/6J小鼠在動(dòng)物中心屏障環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,然后隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)不同的給藥方案組,每組10只小鼠。給藥方案:多次低劑量給藥法(每日腹腔注射1次,連續(xù)5d)3組,STZ劑量分別為60mg/kg、70mg/kg和80mg/kg;一次性給藥法(藥物一次性腹腔注射)兩組,藥物劑量分別為160mg/kg和200mg/kg(分別稱為60mg組、70mg組、80mg組、160mg組和200mg組)。首次給藥前,禁食16h,不禁水,第二天起,不再禁飲食。對(duì)照組給予相同體積的無菌0.1mol/L檸檬酸緩沖液腹腔內(nèi)注射,一日一次,連續(xù)5d。各組小鼠稱重后分籠飼養(yǎng),并分別做好標(biāo)記。1.4血糖、體重、飲食量的檢測(cè)各組小鼠處理后常規(guī)進(jìn)食、飲水。在給藥前以及注射藥物結(jié)束后第1、4、8周和12周等時(shí)間點(diǎn),檢測(cè)小鼠的血糖、體重、飲食量,同時(shí)觀察小鼠的精神狀態(tài)和大小便情況。血糖的檢測(cè):通過剪尾采取尾靜脈血,用快速血糖儀測(cè)定小鼠的隨機(jī)血糖,血糖大于16.7mmol/L并持續(xù)維持在該水平以上,則認(rèn)定小鼠糖尿病模型造模成功。死亡率=死亡數(shù)/樣本量×100%。造模成功率=成模數(shù)/樣本量×100%。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法所有數(shù)據(jù)錄入SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,重復(fù)測(cè)量的計(jì)量資料采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),率的比較采用χ2檢驗(yàn)(Fishers確切概率法),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1后期表現(xiàn)表現(xiàn)模型各組成模后,飲食量明顯增加;尿量明顯增多,需要每日更換墊料;糖尿病小鼠在后期出現(xiàn)精神變差、萎靡,活力減退、脫毛等表現(xiàn)。正常對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)、飲食、大小便等在給藥前后均未見明顯差別,墊料每周常規(guī)更換2次即可。給藥前,對(duì)照組和各不同劑量模型組之間在體重、飲食量和血糖等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2各組大鼠血糖的變化對(duì)照組在給藥期間以及給藥后,血糖均保持穩(wěn)定在4.5~9.3mmol/L。不同劑量模型各組在給藥后1~4周,血糖均有明顯升高,此后各模型組血糖水平均出現(xiàn)不同程度的下降,有些模型不能維持較長時(shí)間,尤以60mg組和160mg組表現(xiàn)明顯,平均血糖值降至10.86~12.65mmol/L。但70mg組和80mg組模型小鼠血糖在第12周仍能持續(xù)維持在20mmol/L以上,有良好的穩(wěn)定性。見表1。2.3各組大鼠體重給藥后體重和所增加量的比較各組小鼠在給藥前平均體重為20.4g左右,隨著鼠齡增大,對(duì)照組小鼠體重逐漸增加,而模型各組體重在給藥后1~4周的體重均明顯下降,尤其70mg組、80mg組和200mg組最明顯;8~12周各模型組體重均有所增加,但仍低于對(duì)照組。糖尿病小鼠表現(xiàn)出明顯“一少”(體重下降)。見表2。2.4糖尿病小鼠飲食量的變化給藥后,各模型組小鼠的日均飲食量均明顯增加,飲食量的改變與血糖的高低具有較密切的聯(lián)系,70mg組和80mg組血糖持續(xù)在較高水平,其飲食量增加也最明顯,飲水量穩(wěn)定在15mL左右,高出對(duì)照組的3倍以上;而60mg組和160mg組飲食量的增加雖不如前兩組明顯,但也明顯高于對(duì)照組,糖尿病小鼠表現(xiàn)出明顯的“多飲”、“多食”。見表3、4。2.5死亡率和血糖水平給藥后,在1~4周,多次低劑量注射的三組模型成模率較高,而一次性注射組成模率不足,尤其是在糖尿病后期(12周),160mg組中沒有一只達(dá)到糖尿病的標(biāo)準(zhǔn),200mg組成模率只有30%。160mg組的死亡率最低,12周時(shí)全部成活,其成模率低主要由于血糖水平不高所致;200mg組第1周是成模率有70%,但由于死亡率較高(12周死亡率達(dá)40%),導(dǎo)致其12周的成模率只有30%。60mg組雖然死亡率很低,在4周成模率也達(dá)70%,但隨時(shí)間延長,血糖降低,第12周的成模率只有30%;80mg組成模率高(1周為100%),存活的小鼠均達(dá)模型標(biāo)準(zhǔn),但死亡率很高,尤其是12周時(shí),死亡率達(dá)70%,因而其后期(12周)的成模率也只有30%;70mg組表現(xiàn)最好,成模率高,死亡率低,12周的成模率為70%,明顯高于其他組。見表5、6。3多次給藥后糖尿病模型的建模實(shí)驗(yàn)糖尿病(DM)為全身代謝性疾病,會(huì)引發(fā)各器官的損害,引起相應(yīng)的并發(fā)癥,這些并發(fā)癥往往需要糖尿病發(fā)生很長時(shí)間后才會(huì)出現(xiàn)。因而,要對(duì)糖尿病的這些并發(fā)癥進(jìn)行研究,首先就需要建立一個(gè)長期而穩(wěn)定的糖尿病模型。STZ是用于誘導(dǎo)建立糖尿病動(dòng)物模型的經(jīng)典藥物,其誘導(dǎo)成DM的基本機(jī)制可能在于B細(xì)胞通過胞膜GLUT2攝取,再通過和(或)甲基化損傷,誘導(dǎo)B細(xì)胞凋亡;DNA損傷使得PARP過度激活而使B細(xì)胞因能量衰竭而死亡;更可能通過抑制OGN使得O-GlCNac堆積,影響胰島素的釋放。由于動(dòng)物的品種、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡炔煌?STZ的使用和管理差異很大,包括給藥方式和劑量、給藥途徑、是否空腹以及是否使用高糖高脂飼料等許多方面。比如在給藥途徑方面就存在靜脈注射、腹腔注射、皮下注射和心內(nèi)注射等諸多不同。另外,STZ具有毒性和副作用,使用劑量過大則小鼠容易出現(xiàn)死亡,劑量不足則成模率不高。因而,選擇怎樣的給藥方式,以及如何確定給藥量,在建立長期的糖尿病模型中顯得非常重要。本實(shí)驗(yàn)中,筆者對(duì)比了多次低劑量注射和一次性注射的給藥方法,以及不同劑量的建模效果,最重要的是觀察長期(12周)的糖尿病模型的成模率。結(jié)果顯示STZ可以很好地誘導(dǎo)小鼠血糖升高,并出現(xiàn)糖尿病典型的“三多一少”癥狀,給藥劑量越大,血糖越高,癥狀也越明顯;另外,無論是一次性給藥還是多次給藥,給藥后的早期,血糖均迅速升高,成模率較高,但隨著時(shí)間延長,血糖有逐漸下降的趨勢(shì),這一特點(diǎn)與文獻(xiàn)的報(bào)道類似。一次性給藥方案中,給藥劑量少(160mg)則成模率很低,大劑量(200mg)組成模率有所升高,但遠(yuǎn)期(12周)的死亡率也明顯增加至40%,導(dǎo)致成模率僅有30%。因而一次性給藥方法并不適合于建立慢性的糖尿病模型。多次低劑量給藥方案中,60mg組死亡率很低,前期的成模率可以達(dá)70%,但到后期血糖逐漸降低,成模率明顯下降;80mg組早期的成模率達(dá)100%,但血糖過高至后期死亡率上升,12周成模率也只有30%;70mg組早期成模率也為100%,死亡率也很低,血糖下降不多,因而12周時(shí)成模率仍高達(dá)70%,是較優(yōu)的給藥劑量?？崭菇o藥可以增加胰島細(xì)胞對(duì)STZ的敏感性,較低的藥物劑量就可以達(dá)到較好的造模效果,筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)中也觀察了非空腹給藥的效果,發(fā)現(xiàn)相同劑量時(shí),成模率低,增加劑量則死亡率上升,所以筆者選擇了空腹注射方法。高糖高脂飲食也是一種誘導(dǎo)糖尿病模型的方法,而高糖高脂飲食聯(lián)合STZ也被研究者用