乳酸菌食品級基因表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展

乳酸菌食品級基因表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展

蘑菇是一個可以用養(yǎng)分產(chǎn)生硫酸的革蘭氏陽性菌的總稱（楊杰斌等人，1996），而乳突陽性細(xì)菌是公認(rèn)的食品安全微生物，已成為食品工業(yè)和制藥等領(lǐng)域的研究熱點（張震等，2009）。乳酸菌作為基因工程菌表達(dá)外源蛋白不會產(chǎn)生內(nèi)毒素,表達(dá)的產(chǎn)物直接與人類健康有關(guān)系。此外,選擇乳酸菌作為表達(dá)宿主菌是因為其具有益生功能,可以通過改善人和動物菌群平衡,對機體產(chǎn)生益生作用,抵御外來致病菌的入侵,對常見致病菌有頡頑作用,并具有調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡、營養(yǎng)、免疫賦活、抗氧化、抗突變和抗輻射作用,以及改善便秘、降低膽固醇、減緩乳糖不耐癥等功效(劉小青等,2009)。乳酸菌自身及其各種代謝產(chǎn)物對機體有營養(yǎng)和免疫功能,而且乳酸菌可以在腸道中定植存活,口服基因工程乳酸菌后,乳酸菌表達(dá)的用于治療或免疫作用的蛋白就可以源源不斷地在腸道中產(chǎn)生并起到相應(yīng)的作用。1表達(dá)能力的測量以乳酸乳球菌為例,幾乎所有的乳酸菌都是植物活性化合物產(chǎn)物的主要宿主菌,這主要是由于它們的食品級地位、高效率的表達(dá)能力及其能夠作為代謝工程的工具(Igor等,2007)。近些年,有關(guān)乳酸菌的一些調(diào)控元件、代謝機制已被研究清楚,并建立了一系列適合乳酸菌的表達(dá)系統(tǒng)(Mathiesen等,2004),包括糖誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)、噬菌體φ31暴發(fā)式誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)、乳鏈球菌素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)、溫控表達(dá)系統(tǒng)等。1.1e.coli和l.lactis近幾年,LAB的遺傳工具得到了很大的發(fā)展(Loir等,2005),包括內(nèi)源性質(zhì)粒的去除、電穿孔方法的建立、各類表達(dá)信號的分離和克隆等,已建立了一系列具有不同用途的克隆載體、表達(dá)載體、選擇標(biāo)記和突變系統(tǒng)。L.lactis有許多優(yōu)點可以用于大規(guī)?；虮磉_(dá),并代替E.coli成為異源蛋白表達(dá)的宿主菌(Mierau等,2005)。Douwe等將草莓中的兩種基因克隆在乳酸桿菌中,并利用尼森誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá),結(jié)果提高了醋酸辛酯和沉香醇在水中的嗅覺閾值,這項研究結(jié)果表明了乳酸菌作為食品級表達(dá)載體的應(yīng)用前景(Igor等,2007)。馬樂輝等(2009)采用試管稀釋法,研究不同來源的食品級的18株乳酸球菌、15株乳酸桿菌和5株雙歧桿菌對nisin的敏感性,初步篩選出17株以nisin作為食品級篩選標(biāo)記的受體乳酸菌,同時篩選出21株食品發(fā)酵、保鮮與貯藏過程中的nisin抗性乳酸菌。1.2食品水平誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)1.2.1糖運轉(zhuǎn)和代謝糖在乳酸菌工業(yè)發(fā)酵中具有重要的作用,因此對糖誘導(dǎo)及其利用進(jìn)行了較為深入的研究。有很多與糖轉(zhuǎn)運和代謝有關(guān)的基因組合成操縱子,可以在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控。目前最具有代表性的是乳酸乳球菌的乳糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。國外用破傷風(fēng)毒素C片段(TTFC)作模型抗原,獲得了許多乳酸菌用于免疫接種的知識,開辟了乳酸桿菌作為活疫苗的真實前景(Ho等,2005)。1.2.2啟動子和33復(fù)制子φ31誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)是基于乳酸菌噬菌體φ31的中期啟動子而構(gòu)建的,可被φ31侵染而誘導(dǎo)表達(dá),并可導(dǎo)致宿主菌的崩解,該系統(tǒng)由φ31啟動子和φ31復(fù)制子組成。系統(tǒng)表達(dá)的一個輔助因素是載體上含有一個同樣也受噬菌體侵染所誘導(dǎo)的φ31復(fù)制原點(oriφ31),誘導(dǎo)后呈現(xiàn)高效復(fù)制。1.2.3激酶nisk基因檢測乳鏈球菌素nisin亦稱乳鏈菌肽,是一種天然、高效、安全、無毒副作用的食品防腐劑。在NICE系統(tǒng)的nisin自主調(diào)節(jié)過程中,組氨酸激酶NisK作為nisin的傳感器,NisR蛋白作為反應(yīng)調(diào)節(jié)子激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。一旦信號如胞外nisin存在,nisin結(jié)合到受體NisK上,隨后,NisK通過磷酸化激活NisR,被激活的NisR在nisA啟動子處誘導(dǎo)nisin操縱子(Kuipers等,1998;Neu等,2003),該系統(tǒng)表達(dá)的產(chǎn)物可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白的10%～60%,產(chǎn)量提高數(shù)千倍,其誘導(dǎo)調(diào)節(jié)過程如圖1所示。1.2.4絲裂霉素調(diào)節(jié)rro和tec基因表達(dá)通過對乳酸桿菌溫和噬菌體ψo(hù)rlt基因全序列的測定和分析,發(fā)現(xiàn)了一個與溶原轉(zhuǎn)變有關(guān)的調(diào)控區(qū),它是由與轉(zhuǎn)錄方向相反的2個基因啟動子(P1和P2)組成,分別控制rro基因(編碼一個阻遏物)和tec基因(編碼Cro的拓?fù)洚悩?gòu)體)的表達(dá)。P2的表達(dá)受到Rro阻遏,加入絲裂霉素可以緩解這種阻遏。通過設(shè)計一個熱不穩(wěn)定性的Rro的阻遏變異體Rrol2,構(gòu)造了溫控表達(dá)系統(tǒng)。1.2.5產(chǎn)酸的ph依賴啟動子乳酸菌最主要的特征之一是產(chǎn)乳酸,pH誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)是根據(jù)LAB的產(chǎn)酸特點發(fā)展而來的。LAB的pH依賴性啟動子常會對其他的環(huán)境因子產(chǎn)生應(yīng)答。在0.5mol/mL的NaCl存在下,這種誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物活性可以提高1000倍以上。1.3異源性基因的轉(zhuǎn)移傳統(tǒng)的乳酸酸菌載體都帶有一個或多個編碼特定抗生素(如紅霉素、氯霉素等)的異源性基因。如果將帶有抗生素抗性基因的菌株投放到環(huán)境或人體、動物體內(nèi),由于抗性基因有轉(zhuǎn)移的可能,將會帶來嚴(yán)重的后果。最有效的方法是使用對人體安全的食品級篩選標(biāo)記來構(gòu)建載體。1.3.1isin和抗nisin特性的比較nisin是乳酸乳球菌產(chǎn)生的由34個氨基酸組成的抗菌素,是一種高效無毒的食品添加劑,菌株產(chǎn)生nisin和抗nisin的特性通常是共存的。很多工業(yè)菌株都具有nisin抗性,限制了它的應(yīng)用范圍。Takala等(2002)構(gòu)建了一個包括pSH71的復(fù)制子、選擇性標(biāo)記nisI基因及啟動子P45食品級克隆載體pLEB590,并在L.lactis成功地表達(dá)了來源脯氨酸亞氨基肽酶的基因pepi。1.3.2去除熱應(yīng)激蛋白嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)含有一個3.2kb的質(zhì)粒,該質(zhì)粒有2個開放閱讀框repA和shsP,后者的基因產(chǎn)物是熱應(yīng)激蛋白(Geis等,2003),把該質(zhì)粒去除后,Strep.thermophilus對熱和酸的抵抗力明顯降低。如果將該基因克隆到?jīng)]有該基因的Strep.thermophilus,該菌又能在60℃和pH3.5條件下生長,利用shsp和Emr作為標(biāo)記構(gòu)建質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化Strep.thermophilus和Lc.lactis,得到高的篩選效率(Demerdash等,2003)。1.3.3supb基因缺失型級載體由乳酸乳球菌一個質(zhì)粒的最小復(fù)制子、乳球菌的赭石突變抑制基因supB及一段人工合成的含有11個限制酶酶切位點的多克隆位點組成一個乳酸菌食品級載體pFG1,載體大小約為2kb。當(dāng)乳酸乳球菌嘌呤生物合成途徑中的基因發(fā)生赭石突變時,表現(xiàn)為嘌呤營養(yǎng)缺陷型。而pFGl載體中的supB基因產(chǎn)物可以抑制這種營養(yǎng)缺陷型,因此supB基因可作為選擇標(biāo)記。Sorensen等(2000)在pFG1的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個新的食品級表達(dá)載體pFG200。pFG200以琥珀突變抑制基因為選擇標(biāo)記,并且除了一小段多克隆位點外全部由乳球菌DNA構(gòu)成,在不含嘧啶培養(yǎng)基中可有效地選擇和保持含克隆載體的菌株。1.3.4lacf基因缺失菌株的構(gòu)建利用糖類選擇性標(biāo)記報道較多,包括乳糖、蔗糖、木糖、蜜二糖等。目前,在乳酸菌的糖類利用中,以乳糖操縱子研究得最為深入。將完整的乳糖操縱子插入到無質(zhì)粒的乳酸乳球菌MG5276的染色體中,然后通過雙交換同源重組使LacF基因失活,細(xì)菌表型為Lac-,當(dāng)將克隆有LacF基因的質(zhì)粒導(dǎo)入LacF缺陷株時,細(xì)菌就恢復(fù)了Lac+表型,并可以通過含乳糖指示劑的溴甲酚紫平板來篩選重組菌落。此外還可利用乳酸菌具有發(fā)酵特殊糖類的表型特征構(gòu)建新的食品級載體,蜜二糖是乳酸菌的一個特殊的發(fā)酵底物,Labrie等(2005)利用棉子糖乳球菌的aga基因的Mel+表型特征開發(fā)了新的選擇標(biāo)記。2通過黏膜免疫檢測siga抗體乳酸菌為厭氧或微厭氧的革蘭氏陽性、非致病菌,能在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)定植,對維持微生態(tài)平衡具有重要作用;作為基因工程菌可簡化表達(dá)產(chǎn)物的后期處理工藝;同腸胃外免疫途徑相比,可通過黏膜免疫產(chǎn)生sIgA抗體;具有免疫佐劑作用及對膽汁酸的抵抗力(呂曉英等,2005)?，F(xiàn)在構(gòu)建乳酸桿菌口服基因工程苗表達(dá)載體的條件都已逐漸完善,只是乳酸桿菌如何誘導(dǎo)小腸產(chǎn)生局