潰瘍性結(jié)腸炎大鼠呼吸道和腸道微生態(tài)的同步動(dòng)態(tài)變化

潰瘍性結(jié)腸炎大鼠呼吸道和腸道微生態(tài)的同步動(dòng)態(tài)變化

1主要病理生理指標(biāo)的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)“肺與結(jié)腸的內(nèi)外關(guān)系”是中醫(yī)特色的腸道理論之一。肺與大腸經(jīng)脈絡(luò)屬,生理上相互協(xié)調(diào),病理上相互影響(肺病及腸,腸病及肺),治療上相互為用(肺病治腸、腸病治肺、肺腸同治)。鑒于該理論在生理、病理、臨床治療等方面的重要意義,開展關(guān)于“肺與大腸相表里”這一臟腑相關(guān)理論的應(yīng)用基礎(chǔ)研究十分必要。有關(guān)潰瘍性結(jié)腸炎(UlcerativeColitis,UC)的前期研究發(fā)現(xiàn),該病可以特異性引起肺支氣管病損,肺損傷是該病的腸外表現(xiàn)之一。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn),UC模型大鼠可出現(xiàn)肺功能減弱和肺組織形態(tài)改變,如肺和支氣管出現(xiàn)上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落、管腔內(nèi)炎性滲出等;從三個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)該模型進(jìn)行的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),“腸病及肺”是否發(fā)生,主要取決于腸病的病理損傷程度,肺臟的病理損傷程度,與腸病的病變時(shí)間成正比。本研究擬從觀察UC大鼠在“腸病及肺”過程中腸道和呼吸道微生態(tài)的同步動(dòng)態(tài)變化切入,探討中醫(yī)“肺與大腸相表里”理論的微生態(tài)機(jī)制。2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2.2實(shí)驗(yàn)方法3結(jié)果3.1各組均大便腸菌的檢測(cè)結(jié)果3.3通過腸道微生物的抗劑b.e值3.4每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群變化曲線3.5不同時(shí)間點(diǎn)呼吸道感染群的變化曲線4腸道菌群失調(diào)UC是一種以累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層的淺表性、非特異性炎癥為主要表現(xiàn)的消化道疾病,其發(fā)病被認(rèn)為是宿主遺傳易感性、黏膜免疫與腸道菌群共同作用的結(jié)果,可能與腸道菌群失調(diào)、腸黏膜屏障功能缺陷、腸道通透性增高以及腸道內(nèi)成分誘發(fā)的異常免疫反應(yīng)等因素有關(guān)。國(guó)內(nèi)外研究一致表明,與正常人相比,UC患者普遍存在不同程度的腸道菌群失調(diào),腸道菌群的改變與UC起病、復(fù)發(fā)密切相關(guān),已成為廣泛共識(shí)。本研究結(jié)果顯示,UC大鼠出現(xiàn)腸道菌群失調(diào),益生菌減少而條件致病菌增多,與國(guó)內(nèi)外同類研究結(jié)論一致。同時(shí),模型大鼠呼吸道部分菌群也出現(xiàn)一定程度的相關(guān)變化。造模第8天,需氧總數(shù)和葡萄球菌在呼吸道和腸道同步增多,厭氧總數(shù)和腸桿菌在腸道增多而在呼吸道減少。造模第29天,需氧總數(shù)和葡萄球菌在呼吸道和腸道同步減少,厭氧總數(shù)和腸桿菌在腸道減少而在呼吸道增多;造模第50天,呼吸道和腸道的需氧總數(shù)、厭氧總數(shù)和葡萄球菌在呼吸道和腸道同步增多?？梢?當(dāng)腸病(UC)時(shí),部分肺、腸菌群可出現(xiàn)同步增多或同步減少,或在腸減少而在肺增多,或在腸增多而在肺減少的相關(guān)變化,提示肺、腸微生態(tài)菌群的變化可能是“腸病及肺”的途徑和表現(xiàn)形式之一。2材料和方法2.1動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)和學(xué)科技學(xué)SPF級(jí)SD雄性大鼠65只,體重(180±20)g,購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司(動(dòng)物合格證號(hào):scxk(川)2008-24)。2.1.2k30008TNBS(SIGMA公司,批號(hào):109k5008);腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基均購(gòu)自北京陸橋生物科技有限公司。2.2.1各組模型動(dòng)物分組65只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后,隨機(jī)分為空白對(duì)照組(30只)和腸病模型組(35只),分別在造模第8天、第29天、第50天隨機(jī)抽取模型動(dòng)物10只處死觀察,構(gòu)成模型1組(腸病第8天組),模型2組(腸病第29天組)和模型3組(腸病第50天組)三組模型?？瞻讓?duì)照組亦分別于上述各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取10只處死與模型組進(jìn)行對(duì)比觀察。2.2.2腸道組織模型的制備以三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇相結(jié)合的方法誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性大鼠UC模型。大鼠以2.4%水合氯醛0.8~1.0mL/100g腹腔注射麻醉后,在石蠟油潤(rùn)滑下,經(jīng)腸道輕緩插入輸液管至距肛門8cm處將100mg/kgTNBS加入等體積50%乙醇,注入大鼠結(jié)腸,然后注入約0.5mL空氣,將大鼠頭部向下傾斜45度放置1min,然后保持平躺自然清醒?？瞻讓?duì)照組大鼠按上述方法給予等量生理鹽水灌腸。造模3d后從模型組隨機(jī)抽取2只大鼠,取結(jié)腸組織,做普通光鏡下病理形態(tài)學(xué)觀察,確定模型是否復(fù)制成功,模型成功標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)。于首次造模后每7d按上述方法和劑量對(duì)模型組大鼠重復(fù)造模,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束?？瞻讓?duì)照組大鼠按上述方法給予等量生理鹽水灌腸。2.2.3腸道菌群的檢測(cè)分別在造模第8天、第29天、第50天隨機(jī)抽取模型組和同時(shí)間點(diǎn)的空白組大鼠各10只進(jìn)行標(biāo)本采集。同步收集結(jié)腸內(nèi)容物和支氣管肺泡灌洗液,用于腸道菌群和呼吸道菌群的同步檢測(cè)。結(jié)腸內(nèi)容物的收集方法:2.4%水合氯醛1.0~1.2mL/100g腹腔注射麻醉,打開腹腔,剖開結(jié)腸,取結(jié)腸內(nèi)容物(糞便)0.1g,加入稀釋液進(jìn)行10倍稀釋備用。支氣管肺泡灌洗液的收集方法:暴露氣管和肺,結(jié)扎左肺,將無菌生理鹽水8mL注入右肺,反復(fù)沖洗,回抽支氣管肺泡灌洗液4~5mL,放入無菌離心管備用。2.2.4腸道菌群的測(cè)定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本經(jīng)10倍系列稀釋后,選擇適當(dāng)稀釋度接種平板,每稀釋度接種2個(gè)平行樣,每個(gè)樣每樣點(diǎn)種20μL,培養(yǎng)后經(jīng)鑒定和計(jì)數(shù)平板上的目標(biāo)菌落數(shù)N1,計(jì)算原始樣品中的菌落數(shù)V。對(duì)結(jié)腸內(nèi)容物標(biāo)本:V(cfu/g糞便)=50N1×稀釋倍數(shù);對(duì)支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本:V(cfu/mL灌洗液)=50N1×稀釋倍數(shù)。再將得到的菌落形成單位(CFU)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)值(lg),完成統(tǒng)計(jì)運(yùn)算。腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)方法參照衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003版第148-153頁調(diào)節(jié)腸道菌群功能檢驗(yàn)方法;需氧細(xì)菌計(jì)數(shù)以及厭氧細(xì)菌計(jì)數(shù)原理參照GB4789.2食品微生物學(xué)檢驗(yàn)之菌落總數(shù)測(cè)定。2.2.5腸道細(xì)菌、腸桿菌、厭氧總數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌的變化采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以(ue0af±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。與空白組比較,腸病模型大鼠第8天腸道需氧總數(shù)、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌顯著增多(P<0.05或P<0.01),而葡萄球菌顯著減少(P<0.05)。腸病模型大鼠第29天腸道葡萄球菌、腸球菌、乳酸桿菌、厭氧總數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯著減少(P<0.05或P<0.01)。腸病模型大鼠第50天腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯著減少(P<0.05或P<0.01)。與腸病模型大鼠第8天比較,腸病模型大鼠第29天腸道需氧總數(shù)、腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、厭氧總數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯著減少(P<0.05或P<0.01);腸病模型大鼠第50天腸道需氧總數(shù)、腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯著減少(P<0.05或P<0.01)。與腸病模型大鼠第29天比較,腸病模型大鼠第50天腸道葡萄球菌和腸球菌均顯著增多(P<0.01)。3.2腸道生物營(yíng)養(yǎng)成分變化見表2。與空白組比較,腸病模型大鼠第8天呼吸道厭氧總數(shù)顯著減少(P<0.01),葡萄球菌顯著增多(P<0.05)。腸病模型大鼠第29天呼吸道菌群無顯著變化(P>0.05)。腸病模型大鼠第50天呼吸道厭氧總數(shù)顯著增多(P<0.05)。與腸病模型大鼠第8天比較,腸病模型大鼠第29天呼吸道需氧總數(shù)和葡萄球菌顯著增多(P<0.01),厭氧總數(shù)顯著減少(P<0.01);腸病模型大鼠第50天呼吸道厭氧總數(shù)顯著增多(P<0.01)。與腸病模型大鼠第29天比較,腸病模型大鼠第50天呼吸道需氧總數(shù)和葡萄球菌顯著增多(P<0.01)。見表3。與空白組比較,模型第8天組和模型第50天組腸道定植抗力顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型第8天比較,模型第29天組和模型第50天組腸道定植抗力顯著增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)。與模型第29天比較,模型第50天組的腸道定植抗力顯著降低(P<0.05)。如圖1所示。各菌種在各時(shí)間點(diǎn)皆出現(xiàn)了變化。除葡萄球菌外,其余各菌種都在模型第8天時(shí)增多,到第29天時(shí)減少,第50天時(shí)又逐步增多。說明腸道菌群在受到腸道疾病影響的作用下,可出現(xiàn)腸道菌群失調(diào),并隨著疾病時(shí)日的延長(zhǎng),出現(xiàn)腸道菌群的逐步調(diào)整變化。如圖2所示。腸病時(shí),呼吸道主要出現(xiàn)變化的菌種是需氧總數(shù)、厭氧總數(shù)、葡萄球菌和腸桿菌。其中變化曲線趨勢(shì)一致的是需氧總數(shù)和葡萄球菌。都是在模型第8天增多,第29天減少,到第50天又增多。此趨勢(shì)與腸道的同一菌群變化趨勢(shì)具有一致性。腸道微生物定植抗力是指腸道內(nèi)源性專性厭氧菌抑制消化道中主要屬需氧菌的潛在致病菌群數(shù)量的能力,1971年由荷蘭微生物學(xué)家Vanderwaaij教授提出。吳仲文和李蘭娟等研究認(rèn)為,糞便中雙歧桿菌與腸桿菌的數(shù)量比值(B/E值)可作為腸道微生物定植抗力指標(biāo)應(yīng)用于臨床。B/E值大于1表示腸道定植抗力正常,B/E值小于等于1表示腸道定植抗力降低。本研究結(jié)果顯示,模型第8天大鼠腸道微生物定植抗力(B/E值)顯著下降,模型第29天B/E值逐漸恢復(fù)至正常狀態(tài),模型第50天B/E值略呈下降趨勢(shì)。提示腸病(UC)發(fā)病可直接導(dǎo)致腸道微生物定植抗力(B/E值)下降,引起嚴(yán)重的腸道菌群失調(diào)或紊亂,病程中腸道微生態(tài)可呈現(xiàn)自我恢復(fù)平衡的能力,