原生質(zhì)體遞歸融合技術選育微生物基因組重排

原生質(zhì)體遞歸融合技術選育微生物基因組重排

21世紀以來，隨著石化資源、能源危機和環(huán)境危機的加劇，以生物技術為原料的生物產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出前所未有的競爭力，促進了工業(yè)菌株育種技術的發(fā)展。傳統(tǒng)育種技術工程量巨大,耗時長,且難于獲取復雜表型。近十幾年里,工業(yè)菌株改造主要集中在代謝工程。該技術主要是運用現(xiàn)代基因手段,對微生物進行定向基因操作。雖然代謝工程育種較傳統(tǒng)育種取得了一定成果,但是基因型和表型相應背景的欠缺會限制其更廣范圍的利用?；蚪M重排技術是一種典型的全面組合技術手段,是全基因組代謝工程的延伸。2002年,Zhang等在Nature上發(fā)表文章,首次提出基因組重排技術——結(jié)合傳統(tǒng)育種技術,通過多親本之間的DNA重組和全基因組片段交換,將優(yōu)良表型重組在一起的過程。Zhang等將基因組重排技術運用于改造弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae),極大的提高了其合成泰樂菌素(tylosin)的能力?；蚪M重排技術具有菌株改造方面的優(yōu)異表現(xiàn),被認為是菌株選育和代謝工程上的一個重大里程碑。1基因組重排技術基因組重排技術作為新型的育種技術,基于原生質(zhì)體融合技術之上,使不同基因組發(fā)生重排的過程。其主要機制在于利用原生質(zhì)體融合達到全基因組片段交換、重組,經(jīng)過多輪遞歸融合后促使正向突變表型聚集,與經(jīng)典誘變育種,原生質(zhì)體融合相比具有明顯的優(yōu)勢(表1)。首先,相較誘變育種、原生質(zhì)體融合技術等,基因組重排技術具有更高的效率。誘變育種具有盲目性、隨機性,導致工程量巨大,時間漫長,菌株突變面臨回復現(xiàn)象的難題。原生質(zhì)體融合技術可以扮演類似于有性生殖途徑基因信息交流的作用,但是有性生殖途徑只能允許在雙親本之間的基因重組?；蚪M重排技術基于多親本之間的遞歸融合,具有更大基因突變來源;遞歸融合還能使正向突變的表型聚集,多輪融合極大的提高了基因交換的概率。Zhang等發(fā)現(xiàn)兩輪的基因組重排取得的成果相當于20年經(jīng)典育種才能完成。綜上,與傳統(tǒng)育種相比較,擴大菌株的基因型和加速菌株進化速度是基因組重排技術最大的優(yōu)勢。其次,基因組重排技術可以無需了解相關微生物的代謝途徑、關鍵酶的表達基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等知識背景,尤其適合微生物代謝途徑的遺傳改造。盡管DNA重組技術可以在多親本之間發(fā)生基因重排,但改變的是基因片段而不是整個基因組。微生物細胞的表型受代謝要求,能源利用,環(huán)境壓力、全基因組水平表達而決定的,所以通過幾個特殊基因的定向改造是很難達到菌株表型的優(yōu)化。而基因組重排技術是全基因組工程策略,在無需知道基因組信息及代謝網(wǎng)絡信息情況下,就可以運用于菌株改良。此外,基因組重排技術操作簡單,容易推廣,不需要昂貴的實驗儀器,而且見效快。因此,基因組重排育種很適合工業(yè)菌株的改造工程,不僅體現(xiàn)成本經(jīng)濟效應,還具備高效性。2原生質(zhì)體的制備和誘導基因組重排技術過程主要分為三步:(1)不同親本原生質(zhì)體的制備;(2)誘導原生質(zhì)體遞歸融合,每輪篩選的目的菌進入下輪融合;(3)根據(jù)目的表型需要設計特殊的選擇培養(yǎng)基,每輪篩選的融合菌株,進入下輪的融合。2.1般篩選準則親本菌株基因的多樣性可以擴大融合菌的基因型,在遞歸融合中促使不同優(yōu)良表型匯集到融合菌中,故基因組重排技術過程的首要任務是創(chuàng)造親本基因型的多樣性。一般手段是傳統(tǒng)誘變育種技術,使菌株產(chǎn)生更多的基因型。作為篩選親本菌株的一般準則是親本菌株必須具有理想的目的表型,如具備特殊環(huán)境高耐受力,產(chǎn)物高產(chǎn)率和菌株高生長率。菌株高生長繁殖率是值得關注的問題,在較高底物及產(chǎn)物濃度等不良環(huán)境下,微生物可以通過高生長率來修復。隨著研究的深入發(fā)展,親本選擇的方式逐漸靈活多樣。John等將徳氏乳酸桿菌的誘變株和含分泌淀粉酶的芽孢桿菌進行基因組重排,結(jié)果收獲了能在木薯渣廢液中生長并轉(zhuǎn)化乳酸能力的融合菌。2.2原生質(zhì)體的誘導基因組重排技術是基于原生質(zhì)體融合技術之上的多輪遞歸融合。多輪遞歸融合確保了不同細胞之間的基因高轉(zhuǎn)移頻率,還保持了基因組重排的高效性。在原生質(zhì)體遞歸融合過程中,首先要制備原生質(zhì)體。制備原生質(zhì)體主要參考的因素有菌齡、酶解濃度、酶解時間及溫度、酶的種類、脫壁輔助溶劑的選擇和滲透壓緩沖劑及再生培養(yǎng)基的設計等。遞歸融合的要義在于進行第一輪融合后篩選的融合菌株作為出發(fā)菌株,必須進入下輪融合。目前,誘導原生質(zhì)體融合的方式主要有生物病毒法,化學法和電處理融合法。化學法和電處理融合法是當前最主要的方法。隨著科學技術的不斷發(fā)展,一些新的工具開始運用于誘導細胞融合。Gong等用激光誘導紅發(fā)夫酵母進行細胞融合。Skelley等運用微流體芯片技術作為誘導細胞融合的技術平臺,明顯提高了融合效率。2.3高耐無氯苯酚的融合菌的分離和鑒定目的融合菌的篩選與分離是整個基因組重排技術流程最為關鍵的步驟?；蚪M重排技術提高菌株對環(huán)境耐受性,可以方便設計含有高濃度的底物或產(chǎn)物的選擇培養(yǎng)基。如Dai等利用基因組重排技術改造Sphingobiumchlorophenolicum提高對底物—五氯苯酚的耐受性,設計的培養(yǎng)基含無氯苯酚濃度依次為0.4mmol/L,3mmol/L,4mmol/L,5mmol/L,結(jié)果在含5mmol/L無氯苯酚濃度的選擇培養(yǎng)基上獲取了3株高耐無氯苯酚的融合菌。篩選高產(chǎn)物的目的菌,經(jīng)典的方法主要依靠產(chǎn)物的物理和化學性質(zhì),如在瓊脂培養(yǎng)基上的抑菌圈、透明圈和水解圈。John等利用能直接水解淀粉的乳酸融合菌產(chǎn)生的透明圈的大小篩選目的高產(chǎn)融合菌。此外,添加遺傳標記可以作為融合菌株的篩選標志,Dai等用基因組重排技術育種革蘭氏陰性細菌室,采用菌體營養(yǎng)缺陷型的遺傳標記篩選目的融合子。最近Zhao等提出了滅活原生質(zhì)體的篩選方法。Hida等研究了產(chǎn)物類似物篩選高產(chǎn)菌株方法,利用羥基檸檬酸的類似物反式環(huán)氧烏頭酸來篩選融合菌。Chen等采用了96目微孔板的體系上培養(yǎng)產(chǎn)雷帕霉素鏈霉菌的融合菌,結(jié)合酶標儀的方法篩選目的融合菌。3菌種表型優(yōu)化基因組重排技術充分結(jié)合了細胞工程和代謝工程的優(yōu)勢,不僅可以進行菌種表型快速高效優(yōu)化,還可為不同種類的微生物復雜的代謝和調(diào)控網(wǎng)絡提供了信息來源。目前,基因組重排技術主要應用于提高微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)率,增強菌株對環(huán)境的耐受性以及底物的利用率。3.1基因組重排技術在微生物工業(yè)發(fā)酵過程中,產(chǎn)物的最終產(chǎn)量和產(chǎn)率直接決定著經(jīng)濟效益?；蚪M重排的對象是細胞內(nèi)整套基因組,在許多情況下,參與次級代謝產(chǎn)物生物合成的結(jié)構基因在染色體上成簇排列,但控制結(jié)構基因表達的調(diào)節(jié)基因則位于生物合成基因簇外,因此將微生物整套基因組視作一個單元進行基因組重排更適合于微生物次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的遺傳改造。2008年,Yu等通過基因組重排技術,對鼠李糖乳酸桿菌經(jīng)過兩輪育種后乳酸產(chǎn)量比野生菌提高了71.4%。在2009年,Jin等研究了Saccharopolysporaspinosa的基因組重排育種工作,經(jīng)過四輪重排后,篩選到了兩株高產(chǎn)多殺菌素的融合菌,生產(chǎn)能力比原始出發(fā)菌株提高了201%和436%。3.2耐酸耐堿類型化分離微生物在環(huán)境中的耐受力水平是極復雜的表型。環(huán)境耐受力的相關特征包括底物的耐受性、產(chǎn)物及副產(chǎn)物的耐受性、溫度的耐受性、對pH和溶氧等因素的耐受性。當前,基因組重排技術已經(jīng)成功應用于提高乳酸桿菌對酸和葡萄糖的耐受性,提高了產(chǎn)普納霉素的Streptomycespristinaespiralis對普納霉素的耐受性,還用于提高了釀酒酵母的熱耐受性和乙醇的耐受性,獲取的融合子可以在55℃下正常生長和能耐受25%(V/V)的乙醇。2007年,Wang等通過對乳酸桿菌的基因組重排育種,經(jīng)過三輪融合后,篩選到了4株能在pH3.6上生長的耐酸融合菌。2009年,Burkhard等應用基因組重排技術最終篩選到了一株耐甘油和1,3-丙二醇的ClostridiumdiolisDSM融合菌,其1,3-丙二醇產(chǎn)量相較原始菌提高了80%。3.3最佳添加量的確定在菌株改良過程中,底物利用效率和范圍也是非常重要的目的表型?；蚪M重排技術同樣適用于提高菌株對底物的利用能力。在2008年,John等利用基因組重排技術,以德氏乳酸桿菌和產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌為親本菌株,經(jīng)過三輪原生質(zhì)體融合后,篩選到了能直接轉(zhuǎn)化淀粉為乳酸的融合菌,結(jié)果表明在83g/L的木薯廢水解液中外源簡單添加輔助成分后,乳酸產(chǎn)量達40g/L。2004年,Dai和Copley利用基因組重排技術對Sphingobiumchlorophenolicum表型改良,經(jīng)過三輪基因組重排后,篩選的融合菌比野生菌具有對五氯苯酚的更高利用率和耐受。3.4基于pgtm的重排后代謝分析基因組重排技術另一重要作用可以提供代謝網(wǎng)絡和調(diào)控的知識?；蚪M重排技術過程,隨著整個基因組片段的重排,從而可以快速達到改進細胞表型或優(yōu)化代謝途徑的目的,同時結(jié)合代謝工程中的各種分析工具對重排后所得到的進化產(chǎn)物(酶、代謝途徑)進行比較分析,可以更好地闡明優(yōu)化的原因或本質(zhì),Gill等提出的一種高通量的并行基因——表型作圖法(parallelgene-traitmapping,PGTM)用于重排后產(chǎn)生的大量嵌合基因組的比較分析,快速確定基因和表型的相關性。2008年,Jin等應用多樣性片段擴增技術分析了由基因重排技術獲得的重組菌株與原始菌株之間的基因差異性。4針對重組技術的應用和前景4.1表型融合菌篩選的重要環(huán)節(jié)基因組重排技術應用菌種改良,由于基因組片段重組也是隨機的并不具備定向性,如何高效篩選目的表型融合菌存在著一定的困難和挑戰(zhàn)?；蚪M重排技術目前普遍運用于同種雙親細胞內(nèi),對于不同種親本細胞之間的報道還是很少,同源性越差,重組概率越低。4.2工程菌株的構建進程