小桐子果皮的殺蟲活性成分篩選

小桐子果皮的殺蟲活性成分篩選

由于種子中含有大量水分，因此在中國熱帶地區(qū)種植了極為適宜的生物柴油原料植物。目前,國內(nèi)外對小桐子殺蟲活性已有少量研究,李靜等(2005)利用種子毒蛋白、種子油、種子乙醇提取物和種子石油醚提取物對桃蚜(Myzuspersicae)、菜青蟲(Pierisrapae)、米象(Riceweevil)和蘿卜蚜(Lipaphiserysimi)進(jìn)行毒殺作用研究;Fagbenroetal.(1998)利用莖枝石油醚粗提物對檸檬鳳蝶(Pappiliodemoleus)3齡幼蟲進(jìn)行殺蟲活性研究;李育川等(2009)利用小桐子枝葉提取物對蚜蟲進(jìn)行了毒殺活性測定,結(jié)果小桐子枝葉乙醇提取物的石油醚萃取物具有很強(qiáng)的毒殺活性。除此之外,尚未見其它報(bào)道。筆者對小桐子果殼殺蟲活性物質(zhì)進(jìn)行分離和初步鑒定,以期為利用小桐子果殼開發(fā)植物源殺蟲劑提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1材料和實(shí)驗(yàn)方法小桐子果殼于2007年10月采自云南永仁縣,經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所郭巧生教授鑒定為麻瘋樹(Jatrophacurcas)的干燥果殼,憑證標(biāo)本(2007109)存放于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所標(biāo)本室。新鮮成熟果實(shí)剝下種子后,將果殼曬干保存粉碎后備用。實(shí)驗(yàn)用的桃蚜(Myzuspersicae)和菜青蟲(Pierisrapae)均采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)下馬坊附近農(nóng)田,經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院孟鈴教授鑒定。美國ThermoFinnigan生產(chǎn)的LC-MS(LCpumpersurvegor、autosamplersurvegor、LCQDECAXPplus)。乙醇、乙酸乙酯和甲醇均為國產(chǎn)分析純。必喜3號(70%吡蟲啉水分散粒劑),由浙江海正股份有限公司生產(chǎn)。吐溫-80,上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)。乙腈為色譜純(Fisher公司),實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。1.2測試方法1.2.1分離萃取樣品按照李育川等(2009)的方法對小桐子果殼先用95%乙醇冷浸提取,減壓濃縮后再將浸膏用水溶解,濾后不溶解丟棄,依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇對小桐子果殼乙醇粗提取物的水溶液進(jìn)行分離萃取,將正丁醇萃取相減壓濃縮,獲得具有殺蟲活性的待分離樣品(A3-4)。1.2.2紫外分光柱3g法第一步,大柱粗分:以硅膠柱H(100～200目)(400g)柱徑8cm,常規(guī)濕法裝柱,硅膠裝柱高度約80cm,取正丁醇萃取物(A3-4)樣品20g上樣,以乙酸乙酯∶甲醇(10∶1、5∶1、1∶2)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,連接HD-5電腦紫外檢測儀(檢測波長275nm)在線檢測,合并同一吸收峰值收集液,將各流份減壓濃縮稱重,結(jié)合活性測定。第二步,中柱細(xì)分:以硅膠柱H(200～300目)(250g)柱徑5cm,常規(guī)濕法裝柱,硅膠柱高度約45cm,取活性較強(qiáng)的A3-4-4樣品3g;以乙酸乙酯∶甲醇(1∶1、1∶1.5)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,將各餾分減壓濃縮稱重,結(jié)合活性測定。具體分離流程如圖1所示:①以乙酸乙酯∶甲醇(10∶1)混合溶液。②以乙酸乙酯∶甲醇(5∶1)混合溶液。③以乙酸乙酯∶甲醇(1∶2)混合溶液。④以乙酸乙酯∶甲醇(1∶1)混合溶液。⑤以乙酸乙酯∶甲醇(1∶1.5)混合溶液。1.2.3不同流份處理液對殘蟲數(shù)的影響根據(jù)李育川(2011)利用小桐子果殼提取物對蚜蟲和菜青蟲活性測試發(fā)現(xiàn),小桐子果殼乙醇提取物對豌豆長管蚜的LC50的95%置信限為3.20～4.29g·L-1的結(jié)果,本研究確定將各流份處理液濃度為8g·L-1處理液。分別準(zhǔn)確稱取各樣品0.8g,分別用加0.8mL吐溫-80,拌勻,使其充分乳化,再用蒸餾水溶解,定容至100mL,制成8g·L-1處理液。對照液用0.8mL吐溫-80加蒸餾水定容至100mL制成。分別采用噴霧法(張宗炳,1988)對桃蚜和菜青蟲進(jìn)行處理。桃蚜每組100頭,菜青蟲每組30頭,每處理設(shè)3個(gè)重復(fù),分別于處理24h后和72h后調(diào)查殘蟲數(shù),計(jì)算死亡率。校正死亡率(%)=×1001.2.4質(zhì)譜條件及質(zhì)譜采集模式HPLC條件:儀器為ThermoElectoncorrporation,色譜柱ZorbaxSB-C18(250mm×2.1mm,5μm),流動(dòng)相為溶劑A(乙腈)︰溶劑B(水)=15︰85,等定洗脫;流速為0.2mL·min-1,自動(dòng)進(jìn)樣0.2μL。質(zhì)譜條件:LCQDECAXPplus(電噴霧離子阱質(zhì)譜儀),離子源為ESI,質(zhì)量分析器為離子阱分析器,正、負(fù)離子檢測模式,毛細(xì)管溫度為275℃,源電壓為5kV,源毛細(xì)管電壓為15kV,質(zhì)量數(shù)范圍100～2000m/z,干燥氣為氮?dú)?進(jìn)樣量為20μL。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式:自動(dòng)質(zhì)譜/質(zhì)譜。高效液相和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和分析采用化學(xué)工作站進(jìn)行(美國,ThermoFinnigan)。1.3數(shù)據(jù)處理和分析數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行方差分析。2結(jié)果與分析2.13a-4樣品柱層析流場的害蟲活性分析2.1.1柱1首先測定每個(gè)樣品中流的害蟲活性(1)昆蟲活性測定將小桐子果殼乙醇粗提物的正丁醇萃取物樣品,如圖1所示進(jìn)行大柱初分,梯度洗脫,共收集到6個(gè)流份;將各流份的收集液減壓濃縮,利用桃蚜分別對6種流份進(jìn)行殺蟲活性測定,測定結(jié)果見表1。殺蟲活性測定結(jié)果表明,編號A3-4-4、A3-4-1和A3-4-5流份對桃蚜都具有毒殺活性,3種流份對桃蚜毒殺活性極顯著高于其它流份,其24h校正死亡率分別是80.35%、48.07%和7.89%,其三者對桃蚜毒殺活性差異極顯著;具有毒殺活性的3個(gè)流份中,編號A3-4-4流份的活性最強(qiáng),雖然其對桃蚜的毒殺活性極顯著低于吡蟲啉,但因其相對數(shù)量最多,值得對其進(jìn)一步分離研究。(2)份對菜青蟲的毒殺活性利用菜青蟲再分別對6種流份進(jìn)行殺蟲活性測定,測定結(jié)果見表2。測定結(jié)果表明:編號A3-4-4流份和A3-4-1流份對菜青蟲都具有毒殺活性,2種流份對菜青蟲毒殺活性極顯著高于其它流份,其72h校正死亡率分別是85.86%和54.83%,其二者對菜青蟲的毒殺活性差異極顯著;具有毒殺活性的2個(gè)流份中,編號A3-4-4流份的活性最強(qiáng),但其對菜青蟲的毒殺活性極顯著低于吡蟲啉,但仍然在80%以上。通過利用桃蚜和菜青蟲對以上6種流份進(jìn)行活性追蹤發(fā)現(xiàn),小桐子果殼中的殺蟲活性物質(zhì)主要存在于編號A3-4-4流份和編號A3-4-1流份中,且其相對含量都較高,值得進(jìn)一步對其進(jìn)行分離研究。2.1.2在3a-4-4中，每個(gè)柱段的屠宰活性由原來的柱段決定(1)各組流份的療效比較經(jīng)過對小桐子果殼乙醇粗提物的正丁醇萃取物進(jìn)行大柱初分,并對各流份進(jìn)行活性追蹤,發(fā)現(xiàn)編號A3-4-4的流份活性最強(qiáng),相對含量也最高。因此選擇編號A3-4-4流份膏,如圖1所示,繼續(xù)進(jìn)行中柱細(xì)分,共收集到3個(gè)流份;將各流份的收集液減壓濃縮,利用桃蚜分別對3種流份進(jìn)行殺蟲活性測定,測定結(jié)果見表3。活性測定結(jié)果表明,編號為WD1流份、WE1流份和WF1流份均對桃蚜具有一定的毒殺活性,其24h校正死亡率分別為了85.66%、23.66%、和25.81%,3種流份對桃蚜的毒殺活性極顯著高于空白對照,顯示出一定的毒殺活性;三種流份中,WD1流份對桃蚜的毒殺活性最高,其極顯著高于WE1和WF1,但低于70%吡蟲啉;WE1和WF1對桃蚜的毒殺活性無顯著差異。(2)種流份對菜青蟲的毒殺活性利用菜青蟲分別對A3-4-4樣品中柱細(xì)分3種餾分進(jìn)行殺蟲活性測定,測定結(jié)果見表4?；钚詼y定結(jié)果表明,所得的流份WD1、WE1和WF1均對菜青蟲具有一定的毒殺活性,其72h校正死亡率分別為了89.51%、31.47%和33.56%,3種流份對菜青蟲的毒殺活性極顯著高于空白對照,顯示出一定的毒殺活性;三種流份中,WD1對菜青蟲的毒殺活性最高,其極顯著高于WE1和WF1,但低于70%吡蟲啉;WE1和WF1對菜青蟲的毒殺活性無顯著差異。由以上結(jié)果看出,三種流份都具有一定的殺蟲活性,其殺蟲活性可能表現(xiàn)為多種物質(zhì)的協(xié)同作用;流份WD1活性極顯著高于其它2種流份,且其相對含量也最高,可以作為指標(biāo)性成分對其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化、鑒定等研究。2.2化合物結(jié)構(gòu)鑒定通過對WD1樣品進(jìn)行HPLC-MS分析,在正、負(fù)離子模式下檢出,各化合物在負(fù)離子模式下都有比較好的響應(yīng)。結(jié)合文獻(xiàn)資料,對圖譜進(jìn)行解析,解析了含量較高的7個(gè)化合物,為總量的80.72%,分別為2α,3β,24-三羥基-12-20(30)-二烯-28-烏索酸、環(huán)辛肽B(CyclgrossineB)、牡荊素(Vitexin)、松香烷二萜(Diterpene)、麻瘋樹酚酮A(JatrophloneA)和CurcusoneA或CurcusoneB。主要屬于二萜類化合物、三萜類、黃酮類、肽及蛋白類化合物,其中二萜最多為5個(gè)。具體如下:化合物1RT:32.82;相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.24%。EI-MS[M]+m/z:485.7、486.7,主要質(zhì)譜數(shù)據(jù)與Kojimaetal.(1991)報(bào)道的2α,3a,24-三羥基-12-20(30)二烯-28-烏索酸相似,鑒定為2α,3a,24-三羥基-12-20(30)二烯-28-烏索酸,為三萜酸?；衔?RT:34.19;相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)20.97%。EI-MS[M]+m/z:781,主要質(zhì)譜數(shù)據(jù)與CatherinAuvinquetteetal.(1997)報(bào)道的化合物環(huán)辛肽B基本一致,鑒定為環(huán)辛肽B(CyclgrossineB)?；衔?RT:34.27;相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.19%。EI-MS[M]+m/z:431.9,與陳泉等(1996)報(bào)道的化合物牡荊素(Vitexin)基本一致,鑒定為牡荊素(Vitexin),為黃酮類?；衔?RT:36.74;相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.29%。EI-MS[M]+m/z:227.1、304.7、327.2、328.3、363.1,質(zhì)譜數(shù)據(jù)與叢浦珠等(2003)報(bào)道的《化合物4781》基本一致,為松香烷二萜化合物。化合物5RT:37.33;相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.71%。EI-MS[M]+m/z:295.4,質(zhì)譜數(shù)據(jù)與Parthasarathyetal.(1984)報(bào)道的化合物香豆素-木脂素,又名麻瘋樹酚酮A(JatrophloneA)一致,為二萜化合物?；衔?RT:38.07;相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.35%。EI-MS[M]+m/z:296,質(zhì)譜數(shù)據(jù)與Naengchomnengetal.(1986)報(bào)道的化合物CurcusoneA或B基本一致,鑒定為二萜化合物?；衔?RT:39.60;相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.97%。EI-MS[M]+m/z:296,質(zhì)譜數(shù)據(jù)與Naengchomneng(1986)報(bào)道的化合物CurcusoneA或B基本一致,為二萜化合物。3化合物的合成及hplc-ms分析將小桐子果殼經(jīng)乙醇提取,依次利用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇對乙醇提取物的水溶液進(jìn)行萃取;選擇活性最強(qiáng)的正丁醇萃取相上硅膠柱進(jìn)行大柱初分,以乙酸乙酯∶甲醇(10∶1、5∶1、1∶2)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,共獲得6個(gè)流份,結(jié)合利用桃蚜和菜青蟲進(jìn)行活性追蹤篩選,篩選出活性強(qiáng)、含量最高A3-4-4流份;將A3-4-4流份濃縮后再上硅膠柱進(jìn)行中柱細(xì)分,以乙酸乙酯∶甲醇(1∶1、1∶1.5)對流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,獲得3個(gè)流份,同時(shí)結(jié)合活性追蹤篩選,獲得含量最高、活性最強(qiáng)的WD1流份;最后將WD1進(jìn)行HPLC-MS分析,鑒定了含量較高的7個(gè)化合物,為總量的80.72%,初步鑒定為2a,3a,24-三羥基-12-20(30)-二烯-28-烏索酸、環(huán)辛肽B、牡荊素、松香烷二萜、麻瘋樹酚酮A、CurcusoneA或CurcusoneB。筆者2011年研究發(fā)現(xiàn),小桐子果殼