GB 4789.13-2012 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌檢驗(yàn) 好

國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)Nationalfoodsafetystandard微生物學(xué)檢驗(yàn)Foodmicrobiologicalexamination產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)ExaminationofClostridiumperfringens趙廣英

GBT4789.13-2012

Clostridiumperfringensx10,000

/cmspweb/datav1/im080014.htm

本節(jié)主要內(nèi)容：

產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的生物學(xué)特性和檢驗(yàn)程序及對(duì)檢驗(yàn)程序的解釋。

目錄第一部分：基礎(chǔ)知識(shí)1.概述2.生物學(xué)特性3.毒素與分型第二部分：國(guó)標(biāo)/bacteriology/archives/2004/09/uuoeoeoeuoeuuu.html

第一部分：基礎(chǔ)知識(shí)1、概述

產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌又稱(chēng)魏/衛(wèi)氏梭菌分布：自然界廣泛存在。易污染食品：動(dòng)物性食品原料食品加熱后未及時(shí)冷卻，所含耐高溫而殘余的產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢會(huì)迅速發(fā)芽，大量繁殖，菌數(shù)可達(dá)數(shù)十萬(wàn)/g，食用前又未加熱，則有可能引起產(chǎn)氣莢膜梭菌食物中毒。食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)的主要目標(biāo)是檢驗(yàn)食品被該菌污染的程度，其重點(diǎn)項(xiàng)目是活菌數(shù)測(cè)定及證實(shí)試驗(yàn)。2、生物學(xué)特性1)形態(tài)與染色

G+無(wú)鞭毛可形成莢膜和芽胞的大桿菌大?。簽?1－2)μmX(2－10)μm。芽孢：卵圓形位于菌體中央或近端，直徑大于菌體的直徑，有的菌株難形成芽胞。莢膜：在人和動(dòng)物活體組織內(nèi)，或在含血清的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)可形成莢膜。Clostridiumperfringens/research/micimm/index.php

www.uni-ulm.de/klinik/imi/mikrobio_2002/krankenversorgung/Diagnostik/Erreger/c_keim.htm2)培養(yǎng)特性*不嚴(yán)格的厭氧*普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上可生長(zhǎng)，若加入葡萄糖、血液則生長(zhǎng)更好。

*適宜生長(zhǎng)溫度為37—47℃。*生長(zhǎng)和繁殖速度極快，在適宜條件下8min/代。*在45℃高溫下可進(jìn)行快速分離純培養(yǎng)，每培養(yǎng)3—4h傳種1次，較易分離純化。

深層葡萄糖瓊脂培養(yǎng)：－－大量產(chǎn)氣，致使瓊脂破碎；牛奶培養(yǎng)基中生長(zhǎng)：－－45度下2h可見(jiàn)到激烈發(fā)酵：庖肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)：－－產(chǎn)生大量氣體，肉渣或肉塊略帶粉紅，但不消化。普通瓊脂平板上培養(yǎng)：－－15h－24h形成S型菌落，在營(yíng)養(yǎng)不足或瓊脂濃度高的平板上可形成R型菌落。

/course/fsc/441/resulex10.htmlat45C，ClostridiumperfringensisvirtuallytheonlyorganismthatwillproducetheStormyFermentation

。鮮血瓊脂平板生長(zhǎng)：

－－菌落周?chē)霈F(xiàn)雙層溶血環(huán)，內(nèi)層溶血完全，外層溶血不完全，好似靶狀，菌落本身略帶灰黃色至淺灰褐色，與空氣接觸30min后，有時(shí)可能逐漸變?yōu)榛揖G色、甚至鮮綠色，這是本菌的特征之一。

ClostridiumperfringensbacteriaonabloodagarplateCourtesyGlennSonger,The

University.ofArizonaCollegeofAgricultureandLifeSciences.

：/articles/01_02/Clostridium_seq.shtmlClostridiumperfringensshowsdouble-zonehemolysisonbloodagar.Notethesmallareaofbetahemolysis(completelysisofredbloodcells)surroundedbyalargerzoneofalphahemolysis(partialhemolysis).Theplateissittingonablacklabbenchwww.cat.cc.md.us/courses/bio141/labmanua/lab16/bloodcp.htmlClostridiumperfringensGrowingonBloodAgar/articles/01_02/Clostridium_seq.shtmlwww.cat.cc.md.us/courses/bio141/labmanua/lab16/bloodcp.html

菌落周?chē)霈F(xiàn)乳光渾濁帶，此反應(yīng)能被本菌的α抗毒素抑制。

*由于發(fā)酵乳糖，菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基顏色發(fā)生變化

*本菌不消化牛奶，不分解游離脂肪，菌落周?chē)怀霈F(xiàn)透明環(huán)及虹彩層（肉毒梭菌可形成）。www.sat.affrc.go.jp/joseki/Anaerobes/Cl_perfringens.htm乳糖牛奶卵黃瓊脂平板上培養(yǎng)新版本不用了3)生化特性

*發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，*液化明膠*還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。*能將亞硫酸鹽還原為硫化物，在含亞硫酸鹽及鐵鹽的瓊脂中形成黑色菌落*發(fā)酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同時(shí)大量產(chǎn)氣，凝塊碎裂，即所謂‘‘暴風(fēng)雨式發(fā)酵”，這是本菌的重要生化特征之一，也是鑒別的主要指標(biāo)。/aaa/micro.html4）抵抗力

A型與C型菌株的芽胞：耐熱性強(qiáng)，煮沸1－3h，繁殖型菌體不耐熱。www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.html3、毒素與分型

毒素：產(chǎn)氣莢膜梭菌能產(chǎn)生外毒素和腸毒素。

外毒素：致死毒素、壞死毒素和溶血毒素，毒性不強(qiáng)不耐熱。還有透明質(zhì)酸酶等酶類(lèi)。腸毒素：不耐熱，60℃經(jīng)10min即可破壞不耐酸，對(duì)堿有抵抗性，對(duì)胰蛋白酶等蛋白分解酶比較穩(wěn)定。

分型：

根據(jù)毒素和抗血清中和試驗(yàn)將此菌分成A，B，C，D，E和F六個(gè)型。

A型：最常見(jiàn)，引起氣性壞疽和食物中毒；A型最早由WelchandNuttal(1892)分離，所以叫衛(wèi)氏/魏氏梭菌

C型：可引起腸炎。

*對(duì)人致病的主要是A、C和F型

*引起食物中毒的主要是A型

1.前言本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.13—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.13—2003相比，主要變化如下：——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱(chēng)；——修改了樣品制備過(guò)程；——修改了培養(yǎng)基與試劑；——修改了操作步驟；——修改了菌數(shù)計(jì)算部分；——增加了附錄A。2.范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗(yàn)。3.培養(yǎng)基和試劑3.1胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.1。A.1.1基礎(chǔ)成分胰胨15.0g大豆胨5.0g酵母粉5.0g焦亞硫酸鈉1.0g檸檬酸鐵銨1.0g瓊脂15.0g蒸餾水900.0mLA.1.2D-環(huán)絲氨酸溶液1gD-環(huán)絲氨酸于200mL臨用前每250mL基礎(chǔ)溶液中加入20mLD-環(huán)絲氨酸溶液碳源、氮源、維生素和生長(zhǎng)因子檢測(cè)硫化氫，＋：菌落中心呈黑色抑制非梭菌細(xì)菌；加熱滅菌失活，過(guò)濾除菌，用前加

3.2液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG）：見(jiàn)附錄A中A.2。

－－大量培養(yǎng)該菌用

胰蛋白胨15.0gL-胱氨酸0.5g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g氯化鈉2.5g硫乙醇酸鈉0.5g刃天青0.001g瓊脂0.75g蒸餾水1000.0mLpH7.1±0.2有效降低氧化還原電位，防止過(guò)氧化物的積累對(duì)菌體產(chǎn)生的毒害；同時(shí)硫氫基團(tuán)有鈍化含砷、汞及其它含重金屬防腐劑的抑菌作用少量瓊脂可以防止二氧化碳、氧氣和還原產(chǎn)物的擴(kuò)散，氧化還原指示劑，氧化態(tài)粉紅色，還原態(tài)無(wú)色注意：臨用時(shí)粉紅色超過(guò)1/3時(shí)，水浴加熱至無(wú)色再用，如全管呈粉紅色時(shí)，不宜再用。

3.3動(dòng)力—硝酸鹽培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A中A.3。

--無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)；還原硝酸鹽為亞硝酸鹽:+3.4乳糖-明膠培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A中A.4明膠液化試驗(yàn)--乳糖發(fā)酵+由紅變黃；明膠液化+

3.5含鐵牛乳培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A中A.5

/course/fsc/441/resulex10.html--發(fā)酵牛奶中的乳糖，產(chǎn)酸，使牛奶凝固，同時(shí)大量產(chǎn)氣，凝塊碎裂，即所謂“暴風(fēng)雨式發(fā)酵”/“暴烈發(fā)酵”，這是本菌的重要生化特征之一，也是鑒別的主要指標(biāo)。觀察2h，5h不發(fā)酵為陰性3.60.1％蛋白胨水稀釋劑：見(jiàn)附錄A中A.54.7革蘭氏染色液。G-3.8硝酸鹽還原試劑:甲萘胺液和對(duì)氨基苯磺酸液：在弱酸性條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸重氮化，再與α－萘胺偶合形成紫紅色。3.9緩沖甘油-氯化鈉溶液：見(jiàn)附錄A中A.9。46℃,2～5h爆發(fā)酵36℃，24h，動(dòng)力—；硝酸鹽還原＋：變紅胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基4.6.結(jié)果與報(bào)告選取典型菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。式中：

T——樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落數(shù)；

A——單個(gè)平板上典型菌落數(shù)；B——單個(gè)平板上經(jīng)確證試驗(yàn)為產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落數(shù)；

C——單個(gè)平板上用于確證試驗(yàn)的菌落數(shù)；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）經(jīng)確證試驗(yàn)有產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板個(gè)數(shù)；n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）經(jīng)確證試驗(yàn)有產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板個(gè)數(shù)；0.1——稀釋系數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）T=∑(A——)BC(n1

+0.1n2)d報(bào)告根據(jù)TSC瓊脂平板上產(chǎn)氣莢膜梭菌的典型菌落數(shù)，按照6.2中公式計(jì)算，報(bào)告每g（mL）樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)，報(bào)告單位以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。復(fù)習(xí)思考題1、食品中產(chǎn)氣莢膜