舟山沿海潮間帶底泥微生物的分離與鑒定

舟山沿海潮間帶底泥微生物的分離與鑒定

海洋微生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在生物、遺傳因素和生態(tài)功能方面具有多樣性。過去10年間,有近5000種新的海洋天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn),其中大多數(shù)是由海洋微生物產(chǎn)生的。作為海洋生物組成種類最多的一類生物,國(guó)外學(xué)者認(rèn)為海洋微生物仍有99.5%～99.9%未被認(rèn)識(shí),因此有著巨大的開發(fā)潛力。作為海洋微生物開發(fā)應(yīng)用的前提,海洋微生物資源多樣性的調(diào)查就有著不言而喻的重要意義。舟山地處長(zhǎng)江、錢塘江、甬江入海口,沿岸流、臺(tái)灣暖流和黃海冷水團(tuán)交匯于此,如此獨(dú)特的海洋環(huán)境蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源。本實(shí)驗(yàn)對(duì)舟山沿海潮間帶海泥中的微生物的組成和抗菌活性進(jìn)行了初步研究,為將來的微生物資源開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1內(nèi)部大層壓結(jié)t樣品采自舟山沿海7個(gè)采樣點(diǎn):長(zhǎng)峙島(CZ)、沈家門漁港(SY)、塘頭(TT)、釣山(DS)、鴨蛋山碼頭(YM)、干欖船廠(GC)、富翅島(FC)的潮間帶海泥(表層以下10～12cm)。采集樣品均保存在無菌瓶中,采樣結(jié)束后當(dāng)天直接用新鮮海泥樣品進(jìn)行菌種分離實(shí)驗(yàn)。1.2蛋白顆粒、酵母膏、牛肉膏的制備放線菌分離培養(yǎng)基包括:(Ⅰ)蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、(Ⅱ)高氏一號(hào)培養(yǎng)基(GAU)、(Ⅲ)AMM培養(yǎng)基;細(xì)菌分離培養(yǎng)基包括:(Ⅳ)Zobell2216E培養(yǎng)基、(Ⅴ)MR2A培養(yǎng)基(Difco)、(Ⅵ)分離培養(yǎng)基(葡萄糖5g,蛋白陳4g,酵母膏5g,牛肉膏4g,瓊脂20g,海水1000mL,pH6.0-6.5,115℃滅菌25min);真菌分離培養(yǎng)基包括:(Ⅶ)查氏培養(yǎng)基、(Ⅷ)馬丁氏培養(yǎng)基、(Ⅸ)馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。所有培養(yǎng)基和稀釋液用陳海水配置。稱取10g海泥,加入盛有90mL滅菌陳海水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,搖床振蕩30min(25℃,8400r/min),取上清液逐級(jí)稀釋為10-1～10-5濃度,每個(gè)梯度取100μL上清接種在固體培養(yǎng)基平板上,在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)肉眼觀察,將所有單菌落分別轉(zhuǎn)接劃線在相同培養(yǎng)基平板上,分離純化。挑出單菌落接種在固體培養(yǎng)基上,置于25℃下繼續(xù)培養(yǎng)3～7d。1.3中國(guó)微生物菌種拮抗實(shí)驗(yàn)指示菌包括:①革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(Escherichiacoli,簡(jiǎn)寫為EC,下同),熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens,PF),副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP);②革蘭氏陽性菌:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,BS),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA),藤黃微球菌(Micrococcusluteus,ML);③白假絲酵母(Candidaalbicans,CA);④黑曲霉(Aspergillusniger,AN),所有菌種均來自中國(guó)微生物菌種保藏中心。采用紙片擴(kuò)散法,以測(cè)量的抑菌圈(直徑Φ)大小來判斷拮抗反應(yīng)的強(qiáng)弱。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基的分離效果采用9種培養(yǎng)基進(jìn)行微生物的分離,結(jié)果見表1。在用于分離放線菌的3種培養(yǎng)基中,蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的分離效果最好;在用于分離真菌的3種培養(yǎng)基中,馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基的分離效果最好;分離細(xì)菌的培養(yǎng)基中,ZOBELL培養(yǎng)基和MR2A培養(yǎng)基效果較好,而MR2A培養(yǎng)基略勝一籌。對(duì)于潮間帶底泥微生物的分離,高氏一號(hào)培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基的分離效果最不理想。2.2菌株的抗菌活性從7個(gè)采樣點(diǎn)分離到488株菌株,按照常規(guī)細(xì)菌學(xué)和真菌學(xué)鑒定方法,確定82株菌株為放線菌(占總菌株的17.6%),331株菌株為真菌(占總菌株的67.8%),71株菌株為細(xì)菌(占總菌株的14.6%),采樣點(diǎn)和菌株分布見表2。用8種指示菌進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:在所有待測(cè)菌株中,有154株菌株具有抗菌活性(占總分離菌株的31.6%),其中抗大腸桿菌的有41株,占26.6%;抗枯草芽孢桿菌的有42株,占27.3%;抗金黃色葡萄球菌的有34株,占22.1%;抗熒光假單胞菌的有9株,占5.8%;抗副溶血性弧菌的有26株,占16.9%;抗藤黃微球菌的有88株,占57.1%;抗黑曲霉的有18株,占11.7%;抗白假絲酵母的有39株,占25.3%。在154株具有抗菌活性的菌株中,對(duì)革蘭氏陽性菌有拮抗作用的有115株,占74.6%,對(duì)革蘭氏陰性菌有拮抗作用的有62株,占40.3%,同時(shí)對(duì)革蘭氏陽性和陰性菌都有拮抗作用的菌株有23株,占14.9%。具較廣抗菌譜和強(qiáng)抗菌活性的菌株見表3。3帶底泥微生物的數(shù)量和分布當(dāng)前對(duì)于海洋微生物的研究大多集中在海洋生物共附生微生物的抗腫瘤、抗菌活性物質(zhì)的提取和分離,極端微生物產(chǎn)酶條件的優(yōu)化等方面,對(duì)潮間帶底泥微生物的數(shù)量和分布進(jìn)行系統(tǒng)研究的較少。研究表明,由于潮間帶初級(jí)生產(chǎn)力程度高,礦物質(zhì)含量豐富,比外海有更高的沉降率,同時(shí)海洋酵母與海洋真菌多喜歡吸附在海泥微顆粒上,因此潮間帶底泥中微生物的數(shù)量比海水中的數(shù)量要明顯增多,但由于臨港工業(yè)發(fā)展和圍海造田等因素,潮間帶的面積在迅速減少,潮間帶微生物的多樣性受到不同程度的破壞,因此對(duì)潮間帶微生物的區(qū)系調(diào)查還是非常必要的。3.1培養(yǎng)基的篩選結(jié)果對(duì)于微生物的分離,恐怕沒有一種培養(yǎng)基可以完全適用于不同微生物。我們針對(duì)細(xì)菌、真菌和放線菌,各選擇了3種常用的分離培養(yǎng)基,通過實(shí)驗(yàn)可知,蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基對(duì)于舟山沿海潮間帶海泥放線菌的分離效果明顯要比高氏一號(hào)培養(yǎng)基和AMM培養(yǎng)基好,出菌率高,培養(yǎng)效果顯著,同時(shí)筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入濃度為50×10-6的重鉻酸鉀并沒有抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng),反而對(duì)放線菌的分離有抑制作用,這種現(xiàn)象在其他文獻(xiàn)中也有報(bào)道,具體機(jī)制可能還有待進(jìn)一步研究。馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基對(duì)舟山沿海潮間帶底泥真菌的分離效果要比查氏培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基顯著,馬丁氏培養(yǎng)基的分離效果最不理想,出菌率比馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基要少兩個(gè)數(shù)量級(jí)。ZOBELL培養(yǎng)基和MR2A培養(yǎng)基對(duì)舟山沿海潮間帶底泥細(xì)菌的分離效果都較好,而用海水制備的R2A培養(yǎng)基雖然價(jià)格比較貴,但培養(yǎng)基質(zhì)量好,分離效果更為顯著。3.2海泥微生物數(shù)量潮間帶富含有機(jī)物和營(yíng)養(yǎng)鹽,微生物資源非常豐富,潮間帶底泥細(xì)菌的一般在103～109CFU/g,而98%的鏈霉菌來自小于3m的海泥中,國(guó)內(nèi)對(duì)沿海潮間帶的微生物研究較少,紀(jì)元等對(duì)江蘇射陽地縣灘涂的微生物數(shù)量進(jìn)行了分析,結(jié)果表明表層灘涂土壤(0～30cm)的細(xì)菌數(shù)量為1.75×107CFU/g,放線菌數(shù)量為1.7×106CFU/g;王書錦等對(duì)遼寧近海的海泥微生物研究結(jié)果顯示,海泥平均含細(xì)菌總量在(2.2～9.6)×104CFU/g,平均真菌總量在(2.2～8.1)×103CFU/g;本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:舟山沿海潮間帶的海泥細(xì)菌總量在7.6×105～1.8×107CFU/g之間,與江蘇沿海地區(qū)灘涂的細(xì)菌總量基本在同一數(shù)量級(jí)上,比遼寧海區(qū)的數(shù)量要多,這可能是東海海區(qū)豐富的營(yíng)養(yǎng)鹽沉積導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量增加;舟山潮間帶的海泥放線菌總量在2.4×103～7.3×104CFU/g之間,比江蘇射陽的灘涂放線菌數(shù)量明顯要少。在7個(gè)采樣點(diǎn)中,鴨蛋山碼頭和沈家門漁港這兩個(gè)地點(diǎn)海泥的放線菌數(shù)量要比其他區(qū)域的數(shù)量明顯減少,但多樣性要強(qiáng),類似情況在國(guó)外也有報(bào)道,其原因可能與碼頭港口來自城市生活污水帶來的富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境有關(guān);舟山潮間帶的海泥真菌總量在3.1×103～5.8×104CFU/g之間,比舟山海域海底沉積物的真菌含量(2250CFU/g)要高,說明潮間帶的真菌比海底沉積物的數(shù)量要多,同時(shí)實(shí)驗(yàn)中我們觀察到各種真菌的顏色明顯,種類眾多,說明潮間帶海泥中真菌的多樣性非常豐富。3.3治療東南角真菌生長(zhǎng)的主要菌種雖然陸地放線菌產(chǎn)生的抗生素占已發(fā)現(xiàn)的天然來源抗生素的2/3以上,但本次實(shí)驗(yàn)分離到有抑菌活性的