中藥注射劑對頭孢他啶抗大腸埃希菌內(nèi)毒素的影響

中藥注射劑對頭孢他啶抗大腸埃希菌內(nèi)毒素的影響

內(nèi)毒素是許多細(xì)胞因子的誘導(dǎo)劑，可以觸發(fā)等級炎癥反應(yīng)。它的成分是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞膜外膜的脂肪性成分。有人認(rèn)為,革蘭陰性細(xì)菌所致的膿毒血癥至今死亡率居高不下,是由于抗菌藥物在殺滅細(xì)菌的同時(shí)伴隨著內(nèi)毒素的釋放,產(chǎn)生高內(nèi)毒素血癥所致。我們據(jù)此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),探討頭孢他啶在臨床用量下對細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生的影響。尋找有效、低毒的抗內(nèi)毒素藥物一直是多年來的研究熱點(diǎn),據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,具有清熱解毒作用的中藥及其注射劑有抗內(nèi)毒素作用,本文模擬臨床用藥劑量、順序及間隔時(shí)間,體外實(shí)驗(yàn)考察了我院常用清熱解毒中藥注射劑清開靈、雙黃連和喜炎平分別與頭孢他啶聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對大腸埃希菌產(chǎn)生內(nèi)毒素的影響,旨為臨床內(nèi)毒素血癥的治療提供參考。1材料和方法1.1材料表面(1)病毒大腸埃希菌ATCC25922,由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。(2)培養(yǎng)基改良型RPMI1640(海克隆生物化學(xué)制品有限公司,批號NSG0059)。(3)針劑、注射液頭孢他啶(每支0.5g,石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司,批號07043001);清開靈注射液(每支10ml,河北神威藥業(yè)有限公司,批號07032622);雙黃連粉針劑(每支600mg,哈藥集團(tuán)中藥二廠,批號0611235);喜炎平注射液(每支50mg,江西青峰藥業(yè)有限公司,批號0080313);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(每支140Eu,中國藥品生物制品檢定所,批號150601-200758);內(nèi)毒素測定試劑盒(湛江安度斯生物公司,批號0609271)。(4)儀器B600A型低速離心機(jī)(白洋離心機(jī)廠);BET-32B細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀(天津大學(xué)無線電廠)。1.2方法(1)細(xì)菌溶液的制備細(xì)菌接種于無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液中,于37℃水浴中培養(yǎng)16h,作為細(xì)菌母液。(2)對大腸桿菌埃希菌的mic采用2倍稀釋法于96孔板中測定頭孢他啶在空白液、清開靈(500倍稀釋液)、雙黃連(0.36mg/ml)及喜炎平(0.01mg/ml)中對大腸埃希菌的MIC。終菌量為5×106CFU/ml左右,37℃保溫箱培養(yǎng)20h。(3)菌種制備及培養(yǎng)細(xì)菌母液臨用前配成約1×108CFU/ml,再分別以RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成所需濃度備用。取5ml離心管若干,各加入2mlRPMI1640培養(yǎng)液,37℃水浴預(yù)熱10min,加入備用菌液50μl,使菌濃度分別為2.5×105、2.5×104、2.5×103、2.5×102及2.5×10CFU/ml,水浴培養(yǎng)3.5h,使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。每個(gè)濃度的菌液組各設(shè)2組(對照組和頭孢他啶組),各加入RPMI1640培養(yǎng)液或頭孢他啶液100μl,使頭孢他啶終濃度為50×MIC(6.25μg/ml)。繼續(xù)水浴培養(yǎng)3.5h,離心取上清液,-20℃保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明方法測定RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)毒素基底值及各組內(nèi)毒素含量。(4)中藥注射液的制備菌液制備如上述。取5ml離心管若干,加入2mlRPMI1640培養(yǎng)液,37℃水浴預(yù)熱10min,加入備用菌液50μl,使終菌濃度為2.5×102CFU/ml,水浴培養(yǎng)3.5h,中藥注射劑與終濃度為50×MIC的頭孢他啶液各100μl先后加入(頭孢他啶液在中藥注射劑加入之前或之后1.0h加入),中藥注射劑的終濃度為:清開靈500倍稀釋液,雙黃連0.36mg/ml及喜炎平0.01mg/ml。繼續(xù)水浴培養(yǎng)3.0h,離心取上清液,-20℃保存?zhèn)溆?。?nèi)毒素測定方法同上。(5)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以xˉ±s表示,組間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。2結(jié)果2.1清開靈和喜炎平制劑頭孢他啶的MIC為0.125μg/ml,清開靈和喜炎平注射劑對其MIC值無影響,但雙黃連注射劑可使頭孢他啶的MIC增至32μg/ml以上。2.2內(nèi)毒素的測定RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)毒素基底值為零,培養(yǎng)液對內(nèi)毒素測定沒有影響。在菌濃度較高時(shí),50×MIC頭孢他啶對大腸埃希菌內(nèi)毒素的生成有誘導(dǎo)作用;菌濃度較低時(shí)可顯著降低內(nèi)毒素含量(表1)。2.3降低內(nèi)毒素的作用中藥注射劑與頭孢他啶的加入順序?qū)?nèi)毒素含量有影響,當(dāng)中藥注射劑晚于頭孢他啶1h加入時(shí),清開靈和喜炎平均可顯著降低內(nèi)毒素含量,后者效果好于前者,但雙黃連未顯示出降低內(nèi)毒素的作用。當(dāng)中藥注射劑早于頭孢他啶1h加入時(shí),3種中藥注射劑均未顯示其抗內(nèi)毒素作用(表2)。3新生兒血液中抗菌藥物分布抗生素對細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生的影響與多種因素有關(guān),如青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的種類、抗生素的濃度等。頭孢他啶、頭孢噻肟等抗生素在低濃度時(shí)與PBP-3結(jié)合,使細(xì)菌成細(xì)絲狀,有較大表面積,可產(chǎn)生較多內(nèi)毒素;在高濃度時(shí)與PBP-1結(jié)合,快速殺死細(xì)菌,使之溶解,產(chǎn)生較少量內(nèi)毒素。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),內(nèi)毒素產(chǎn)生還與細(xì)菌濃度相關(guān),頭孢他啶在臨床應(yīng)用劑量(50×MIC)時(shí),可在高菌液濃度(2.5×104～2.5×105CFU/ml)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量內(nèi)毒素,而在低菌液濃度(2.5×10～2.5×103CFU/ml)使內(nèi)毒素含量大幅度降低。臨床數(shù)據(jù)顯示,敗血癥成年患者血液中的菌濃度相對較低(<10CFU/ml),而幼兒患者特別是新生兒血液中的菌液濃度相對較高,最高在1000CFU/ml左右。從本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出,菌液濃度在小于2.5×103CFU/ml時(shí),頭孢他啶在殺菌的同時(shí)是降低內(nèi)毒素含量的,所以,認(rèn)為革蘭陰性菌敗血癥死亡率居高不下是由于應(yīng)用抗生素后誘導(dǎo)產(chǎn)生大量內(nèi)毒素的看法值得商榷,但應(yīng)知道少量內(nèi)毒素的持續(xù)存在可能對患者的危害更大。由于內(nèi)毒素廣泛的組織損傷作用,使得如何對抗內(nèi)毒素以減少其有害反應(yīng)成為廣大醫(yī)藥工作者的關(guān)注熱點(diǎn),各國藥典對注射劑中內(nèi)毒素的含量都有嚴(yán)格限制,以阻止內(nèi)毒素的攝入,但由于內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及其作用的多樣性,使抗內(nèi)毒素藥物的研究顯得頗為困難,目前有確切抗內(nèi)毒素作用的化學(xué)藥品和生物制品除多黏菌素B外,皆處于研制或臨床研究階段。在我國,中藥抗內(nèi)毒素的研究比較廣泛,其中具有清熱解毒作用的中藥顯示了很好的抗內(nèi)毒素作用,本實(shí)驗(yàn)對清熱解毒中藥注射劑清開靈、雙黃連和喜炎平與頭孢他啶聯(lián)合用藥對細(xì)菌內(nèi)毒素的對抗作用進(jìn)行研究,結(jié)果顯示清開靈、喜炎平注射劑不影響頭孢他啶的MIC,并可顯著降低內(nèi)毒素含量,但加藥順序?qū)Υ俗饔糜泻艽笥绊?當(dāng)中藥注射劑在頭孢他啶之后應(yīng)用時(shí),可顯著降低內(nèi)毒素含量,喜炎平的效果更明顯;但當(dāng)在頭孢他啶之前應(yīng)用時(shí),卻對內(nèi)毒素含量沒有降低作用,可見抗生素、內(nèi)毒素與中藥注射劑之間的關(guān)系并不是單純的是否影響MIC值的問題,其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。雙黃連注射劑為清熱解毒中藥制劑,具有抗菌和抗病毒作用,雖然在體外實(shí)驗(yàn)中其殺菌作用很弱,幾乎無臨床意義,但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)卻顯示了很強(qiáng)的抗菌效果,如雙黃連注射劑可顯著降低大腸埃希菌所致小鼠腹腔感染的死亡率,與頭孢他啶聯(lián)用治療慢性阻塞性肺疾病時(shí)有顯著的協(xié)同作用,體外實(shí)驗(yàn)也顯示有很強(qiáng)的抗內(nèi)毒素作用,但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雙黃連注射劑與頭孢他啶聯(lián)合應(yīng)用后,沒有顯示出