部提部提取法對部提物玉龍掌血抑菌活性研究

部提部提取法對部提物玉龍掌血抑菌活性研究

又名龍眼血、發(fā)血和散血丹，為廣東科龍眼血科成員。分布在中國秦嶺南坡及其南部省份。祖國醫(yī)學(xué)認為其具有舒筋通絡(luò)、活血散瘀、消腫止痛的作用,常用于治療風(fēng)濕痹痛、胃痛、痛經(jīng)、跌打損傷?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,其具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗心肌缺血、治療家畜胃腸炎等作用,但對其抑菌作用的研究尚未見研究報道。目前,中藥有效成分的提取方法有經(jīng)典的溶劑提取法,本文作者以蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚等作提取溶劑,采用冷浸或加熱回流等方式,對飛龍掌血的提取工藝及提取物的抑菌作用進行了相關(guān)研究,旨在為該植物的進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1材料、機器和試劑1.1菌株的選擇和保藏飛龍掌血:2005年3月采于湖南省永定區(qū)后坪鎮(zhèn),經(jīng)本院廖博儒副教授鑒定。洗凈、涼干、粉碎,過24目篩,冷藏備用。實驗菌種:供試菌種枯草桿菌(Bacillussubtilis)、痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)、啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae),(枯草桿菌為常見環(huán)境衛(wèi)生細菌,屬革蘭氏陽性細菌;痢疾桿菌屬革蘭氏陽性細菌,為常見腸道病原菌;啤酒酵母菌為常見真菌,這3種菌種與人類、環(huán)境都有密切的聯(lián)系。)購自湖南省疾病預(yù)防控制中心,湖南省林產(chǎn)化工工程重點實驗室冷凍保藏。培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基。1.2儀器和超凈操作臺RE540-AW旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本,Yamato)、DP-32真空干燥箱(日本,Yamato)、IL-62培養(yǎng)箱(日本,Yamato)、HM-60V酸度計(上海)、EB-340HW電子天平(日本,島津)、PCV-130BN超凈操作臺(日本,Hitachi)。1.3試劑無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚(沸程60～90℃)均為國產(chǎn)分析純。2方法2.1龍眼血提取物的制備2.1.1內(nèi)生物浸提液制備稱取飛龍掌血100g4份,分別加入蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚各600mL置于避光處(20～25℃)浸提72h,過濾,將所得提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(55℃,80r/min)得到的提取物浸膏即為生藥。2.1.2熱水回收法同2.1.1節(jié)操作,冷浸提取72h改為熱水回流提取5h。2.2龍眼血抑制實驗2.2.1采用濾紙擴散法測定了龍眼掌血提取物的抑菌作用參照文獻操作,以相對應(yīng)的溶劑為對照,平行3份,37℃,12h后測抑菌圈直徑。2.2.2充分發(fā)揮抗血藥的作用將2.1.1節(jié)得到的飛龍掌血無水乙醇浸膏用無水乙醇溶解,定容至25mL。得到100g飛龍掌血的無水乙醇提取物的母液,記為4.00g/mL。吸取一定量母液配制成質(zhì)量濃度分別為0.00、0.25、0.50、1.00、2.00和4.00g/mL的飛龍掌血無水乙醇提取液,同2.2.1節(jié)操作,測量抑菌圈直徑大小,比較抑菌效果。2.2.3ph值對抗菌活性的影響根據(jù)2.2.2節(jié)的結(jié)果選用提取物生藥質(zhì)量濃度為0.5g/mL的飛龍掌血無水乙醇提取物進行實驗,調(diào)節(jié)pH值為6、7、8、9,同2.2.1節(jié)操作,測定抑菌效果。3結(jié)果與討論3.1提取方式的確定以相對應(yīng)的溶劑為對照,以抑菌圈直徑大小表示抑菌效果(重復(fù)4次,取平均值)。不同提取劑、不同提取方法的飛龍掌血提取物(生藥質(zhì)量濃度為1.00g/mL)的抑菌效果見表1。冷浸72h與熱水回流5h之間沒有顯著性差異,提示若以抑菌效果為考察指標,可選擇冷浸或加熱回流的提取方式,但采用加熱回流法節(jié)省時間。石油醚、水的提取物的抑菌效果顯著;無水乙醇、乙酸乙酯,提取物抑菌效果顯著或極顯著,且與水提物比較有顯著差異,無水乙醇與乙酸乙酯提取物之間沒有顯著區(qū)別,考慮到乙醇成本低及回收容易,本研究選擇無水乙醇作為提取劑,方法選用加熱回流提取5h。3.2生藥質(zhì)量濃度對抑菌效果的影響無水乙醇提取物生藥質(zhì)量濃度(g/mL)的抑菌效果(重復(fù)4次,取平均值)見表2。隨飛龍掌血的無水乙醇提取物生藥質(zhì)量濃度的增加,其對3種菌的抑菌效果增強,當質(zhì)量濃度為0.25g/mL時與無水乙醇對照組相比對痢疾桿菌、啤酒酵母菌、枯草桿菌的抑菌效果差異極顯著,當質(zhì)量濃度為0.5g/mL時的抑菌效果趨于平衡(與0.25g/mL時比較,差異顯著),再增加濃度,其抑菌效果增加不顯著,因此,0.5g/mL為較好的生藥質(zhì)量濃度。3.3兩種微堿性條件下抑菌效果比較pH值對無水乙醇提取物抑菌效果有影響,且對不同菌種的影響效果不同(重復(fù)4次,取平均值),見表3。對痢疾桿菌:飛龍掌血無水乙醇提取物在pH值為6時的抑菌效果比7和8要好,差異顯著,pH值為9比7和8的效果要好,差異顯著,但pH值為6與9之間差異不顯著,提示在微酸微堿性條件下對痢疾桿菌抑菌效果較好,在中性條件下的抑菌效果較弱;對枯草桿菌:pH值為9時與pH值6、7、8比較有顯著差異,其它沒有顯著性,提示在微堿性條件對枯草桿菌的抑菌作用比中性、微酸性條件下強;對啤酒酵母菌:隨著pH值的增大而抑菌效果有減小趨勢,其中pH值為6的效果較好,與pH值為7、8、9比較差異極顯著,pH值在7、8、9之間沒有顯著性區(qū)別。4不同質(zhì)量濃度充分發(fā)揮抑菌效果4.1以飛龍掌血提取物的抑菌效果為考察指標,加熱回流的方法節(jié)約時間,加熱5h的效果與冷浸72h的效果相當,且用無水乙醇作提取溶劑成本低易回收,且提取物抑菌效果顯著。4.2通過對不同質(zhì)量濃度下的飛龍掌血乙醇提取物進行抑菌實驗發(fā)現(xiàn),在生藥質(zhì)量濃度0.5g/mL下抑菌作用較強,再增大濃度其抑菌效果增加