天然提取物清除自由基的研究

天然提取物清除自由基的研究

皮膚腐爛和身體腐敗一樣，是一個(gè)復(fù)雜的生物過程。對(duì)此學(xué)者們有各種解釋,如自由基學(xué)說、遺傳學(xué)說、交聯(lián)學(xué)說、免疫學(xué)說等,其中自由基學(xué)說是目前國內(nèi)外較普遍認(rèn)同的一種。自由基是一類外層軌道含有未配對(duì)電子的原子團(tuán)或特殊狀態(tài)分子,其中與人體關(guān)系最為密切的是氧自由基,如超氧自由基(O-2)、羥基自由基(·OH)、脂自由基(ROO·)等,其中以O(shè)÷2形成最早,·OH作用最強(qiáng)。它們攻擊生物大分子,如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、聚不飽和脂肪酸(PUFA)等,使其交鏈或斷裂,引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞,可在皮膚上形成色斑、皺紋及引起其他皮膚病變,造成皮膚的衰老。因此尋找能夠有效清除自由基(特別是O÷2和·OH)而無副作用的物質(zhì)添加于化妝品中(如SOD),而從天然動(dòng)植物,尤其是從具有悠久歷史的中草藥中尋找高效的自由基清除劑,更引起了國內(nèi)外學(xué)者及化妝品廠家的極大興趣。我們對(duì)一些中藥進(jìn)行了提取,用比色法測(cè)定了這些提取物對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O÷2及Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH的清除作用,以期找到合適的化妝品添加劑,添加于延緩皮膚衰老化妝品中。1實(shí)驗(yàn)部分1.1材料表面1.1.1試劑除三羥甲基氨基甲烷(Tris)為進(jìn)口分裝外,其余試劑均為國產(chǎn)分析純或國產(chǎn)生化試劑。配制用水均為二次蒸鎦水。1.1.2儀器UV-754型紫外可見分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠),超級(jí)恒溫水浴(上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠)。1.1.3藥材、藥品與藥材車前子(PlantagoasiaticaLinne)、當(dāng)歸[Angelicasineusis(oliv.)Diels]、川芎(LigusticumchuangxiongHort)、茯苓[Poriacocos(Schw.)Wolff]粉碎,各稱取若干克,先以雙蒸水浸泡24h,然后煮沸提取3次,每次1h,過濾,合并濾液,離心取上清層,濃縮備用。薏苡仁[Coixlaeryma-jobiL.var.ma-yuan(Roman)Stapf]按文獻(xiàn)提取薏苡仁A物質(zhì)。益母草(LephurusheterophyllusSweet)按文獻(xiàn)提取益母草K物質(zhì)。丹參(SalviamiltiorrhiyaBunge)按文獻(xiàn)提取總丹參酮。黃芪(AstrgalusL)按文獻(xiàn)提取黃芪總黃酮。以上藥材均購自上海市靜安區(qū)藥材經(jīng)營總公司。蘆丁、槲皮素由中國科學(xué)院上海藥物所提供。1.2方法1.2.1最大吸收劑量的確定,把蘆丁、槲皮素、黃芪總黃酮vict按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行,同時(shí)參考?？傮w積3mL的反應(yīng)液含下列試劑(以最終濃度表示):Tris-HCI緩沖液,pH=8.20,50mmol;二乙三胺五醋酸,1mmol;鄰苯三酚,0.2mmol;不同濃度的待測(cè)樣品。反應(yīng)在25℃恒溫水浴中進(jìn)行,加入鄰苯三酚引發(fā)反應(yīng)(鄰苯三酚以10mmolHCI溶解并25℃預(yù)熱),準(zhǔn)確反應(yīng)5min,加入30μL100mmol的DL-二巰蘇糖醇(DTT)終止反應(yīng),1h內(nèi)記錄325nm處的吸光度值(A)。樣品蘆丁、槲皮素、黃芪總黃酮為油溶性物質(zhì),以少量甲醇溶解供測(cè)試用,并以等量甲醇做隨行空白。以抗壞血酸(VitC)作陽性對(duì)照物。按下式計(jì)算各樣品對(duì)O÷2的清除率(I%):I%=[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100A1:不含樣品的吸光度值A(chǔ)2:不含樣品和鄰苯三酚的吸光度值A(chǔ)3:含有樣品的吸光度值A(chǔ)4:含樣品,但不含鄰苯三酚的吸光度值1.2.2總黃酮、蘆丁、槲皮素的合成按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行,同時(shí)參考。總體積3mL的反應(yīng)液含下列試劑(以最終濃度表示):水楊酸,2.5mmol;乙二胺四乙酸二鈉,0.5mmol;FeSO40.5mmolH2O2,1mmol;KH2PO4-KOH緩沖液,pH=7.40,0.25mol;不同濃度的待測(cè)樣品。反應(yīng)在25℃恒溫水浴中進(jìn)行,加入H2O引發(fā)反應(yīng),反應(yīng)進(jìn)行2h后,加入60μL12molHCl結(jié)束反應(yīng)。以6mL冷乙醚振搖萃取反應(yīng)液2min,吸取上層乙醚液4.5mL,于40℃水浴蒸干乙醚,然后依次加入雙蒸水2mL、10%三氯乙酸(W/V)0.15mL(以0.5molHCl配制)、10%鎢酸鈉(W/V)0.25mL、0.5%亞硝酸鈉(W/V)0.25mL,混勻;放置5min,加0.25mL1molKOH后,立刻于510nm處測(cè)吸光度值(A)。樣品黃芪總黃酮、蘆丁、槲皮素為油溶性物質(zhì),以少量丙酮溶解供測(cè)試用,并以等量丙酮做隨行空白。以VitC做陽性對(duì)照物。以下式計(jì)算各樣品對(duì)·OH的清除率(I%):I%=[1-(AⅢ-AⅣ)/(AⅠ-AⅡ)]×100AⅠ:不含樣品的吸光度值A(chǔ)Ⅱ:不含樣品和H2O2的吸光度值A(chǔ)Ⅲ:含有樣品的吸光度值A(chǔ)Ⅳ:含樣品,但不含H2O2的吸光度值對(duì)于每種樣品,以清除率為縱坐標(biāo),樣品濃度為橫坐標(biāo),以清除率50%的濃度(半數(shù)清除濃度,IC50)比較其清除O÷2或·OH的能力。2結(jié)果2.1量效關(guān)系及提取物的提取從表1可見除黃芪總黃酮外,其余樣品對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O÷2都有清除作用,且清除能力與濃度均呈明顯的量效關(guān)系。根據(jù)ID50,它們清除O÷2的能力依次為,純化合物:VitC>蘆丁>槲皮素;固體提取物:益母草K物質(zhì)>總丹參酮;液體提取物:當(dāng)歸水提取物>車前子水提取物>川芎水提取物>茯芩水提取物>薏苡仁A物質(zhì)。2.2清除酶的量效關(guān)系從表2可見,除了黃芪總黃酮、益母草K物質(zhì)外,其他樣品對(duì)·OH均有清除作用,且清除能力與濃度有明顯的量效關(guān)系。根據(jù)ID50,它所清除·OH的能力依次為,純化合物:VitC>蘆丁>槲皮素;固體提取物:黃芪總黃酮>總丹參酮;液體提取物:當(dāng)歸水提取物>車前子水提取物>川芎水提取物>薏苡仁A物質(zhì)。3清除劑對(duì)oh的檢測(cè)3.1能夠產(chǎn)生O÷2的體系很多,如鄰苯三酚、腎上腺素、6-羥基多巴胺的自氧化體系;黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系、乳酸-乳酸脫氫酶體系、核黃素光氧化體系、堿性二甲基亞砜體系等。檢測(cè)O÷2的方法也很多,有化學(xué)發(fā)光法、電子自旋共振法、電子順磁共振法、放射免疫法、比色法(采用細(xì)胞色素C、氮藍(lán)四唑等)、極譜氧電極法等。本文采用了鄰苯三酚自氧化的比色分析法,這種方法所用試劑及儀器比較簡(jiǎn)單,測(cè)試方便,穩(wěn)定性好,重現(xiàn)性好,其靈敏度與經(jīng)典方法(黃嘌呤氧化酶-細(xì)胞色素C法)相當(dāng),適宜于在一般實(shí)驗(yàn)室采用。鄰苯三酚在自氧化過程中,產(chǎn)生O÷2同時(shí)產(chǎn)生有色中間物質(zhì),如加入O÷2清除劑,便可抑制鄰苯三酚的自氧化,同時(shí)也抑制了有色中間物質(zhì)的產(chǎn)生,通過比色便可得出O÷2清除劑對(duì)O÷2的清除效力。能夠產(chǎn)生·OH的體系也很多,如Fenton反應(yīng)體系、還原型谷胱甘肽-過氧化氫體系、煙酰胺嘌呤磷酸二核苷酸-H2O2體系、抗壞血酸-H2O2體系、抗壞血酸-Cu2+體系、水的輻射體系等,其中最常用的是Fenton反應(yīng)體系。對(duì)·OH的檢測(cè)方法有氣相色譜法、液相色譜法、電子順磁共振法、電子自旋共振法、化學(xué)發(fā)光法、比色法等,其中比色法比較簡(jiǎn)便,適宜在一般實(shí)驗(yàn)室采用,其他方法則需要昂貴的儀器,操作也復(fù)雜。本文采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH,以比色法檢測(cè)產(chǎn)生的·OH。Fenton反應(yīng)是生物體內(nèi)產(chǎn)生·OH的主要反應(yīng),可簡(jiǎn)單表示為:(Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH),·OH可攻擊芳環(huán)化合物(如水楊酸)產(chǎn)生羥基化產(chǎn)物(2,3-二羥基苯甲酸等),這些羥基化產(chǎn)物與顯色物質(zhì)反應(yīng)可呈色,以比色法可測(cè)得,如向反應(yīng)體系中加入·OH清除劑,則·OH減少,羥基化產(chǎn)物也相應(yīng)減少,由此可推算·OH清除劑清除·OH的效力。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,做為陽性對(duì)照物的VitC對(duì)O÷2及·OH均有極強(qiáng)的清除作用,這與文獻(xiàn)的報(bào)道是一致的。VitC做為抗皺、美白的活性添加劑,已廣泛使用于各種化妝品中,但其性質(zhì)不穩(wěn)定,易氧化,故常用其衍生物。蘆丁、槲皮素廣泛存在于天然植物中,是植物黃酮類成分較有代表的物質(zhì)。據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,它們對(duì)O÷2及·OH均具有很強(qiáng)的清除能力(其中蘆丁稍強(qiáng))。這兩種物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定,且還有很強(qiáng)的紫外線吸收性能(防曬性能),對(duì)皮膚炎癥有減輕作用,另外還有抗菌、抗過敏的作用。從理論上講,是理想的化妝品添加劑,認(rèn)為應(yīng)該進(jìn)一步研究其透皮性能以及用于化妝品的安全性。益母草古代曾用于美容,據(jù)《新修本草》記載是武則天的美容秘方,根據(jù)使用方法,估計(jì)有效物質(zhì)應(yīng)是生物堿類成分。益母草K物質(zhì)是益母草活血化瘀的有效部分,也屬于生物堿類。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,其對(duì)O÷2有一定清除作用,IC50=0.29mg/mL,對(duì)·OH在0mg/mL～0.5mg/mL范圍內(nèi)無清除作用。認(rèn)為應(yīng)該對(duì)此K物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分離,用O÷2清除試驗(yàn)來尋找活性更強(qiáng)的部位。黃芪是最常用的抗衰老中藥之一,其黃酮類成份是抗衰老的主要成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃芪總黃酮對(duì)O÷2在0mg/L～0.15mg/mL范圍內(nèi)無清除作用,但對(duì)·OH卻有很強(qiáng)的清除作用,0.04mg/mL達(dá)到88.61%,(VitC0.05mg/mL清除率為81.78%)應(yīng)對(duì)黃芪總黃酮進(jìn)行深入研究,它很可能成為一種高效的·OH清除劑。丹參是常用的活血化瘀中藥,用來治療心絞痛。文獻(xiàn)報(bào)道丹參酮ⅡA磺酸鈉有很強(qiáng)的清除O÷2及·OH的能力。我們對(duì)總丹參酮進(jìn)行了測(cè)試,結(jié)果表明總丹酮有一定的清除能力,但作用較小,可能與其有效