褪黑素對大鼠腦內(nèi)微透析液中n

褪黑素對大鼠腦內(nèi)微透析液中n

脫黑素（mlt）是一種由果體產(chǎn)生的神經(jīng)內(nèi)外激素，具有重要的生理和藥理作用。有報道,外源性給予MLT可顯著提高動物痛閾并可被納洛酮所拮抗。我們先期工作提示,中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能是MLT發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的重要部位,其作用機(jī)制涉及腦內(nèi)內(nèi)阿片肽系統(tǒng)。眾所周知,腦內(nèi)β-內(nèi)啡肽(β-Ep)在痛覺調(diào)制和鎮(zhèn)痛中發(fā)揮重要作用。去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)是腦內(nèi)參與痛覺調(diào)制的重要神經(jīng)遞質(zhì),其在腦內(nèi)主要代謝產(chǎn)物分別為3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇(MHPG)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA);中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)、下丘腦為參與痛覺調(diào)制的重要腦區(qū),PAG、下丘腦均有NE能及5-HT能神經(jīng)纖維支配。因此,本文用腦內(nèi)推挽灌流技術(shù)結(jié)合痛閾測定、放射免疫測定法,觀察MLT發(fā)揮顯著鎮(zhèn)痛效應(yīng)時第三腦室灌流液中β-Ep含量的變化,并用腦內(nèi)微透析技術(shù)及高效液相色譜電化學(xué)檢測技術(shù),觀察MLT對PAG、下丘腦微透析液內(nèi)MHPG及5-HIAA含量的影響,以探討MLT鎮(zhèn)痛作用與腦內(nèi)β-Ep,NE及5-HT釋放的關(guān)系。堅持大鼠在體內(nèi)快速投送藥物藥品與試劑MLT為Sigma公司產(chǎn)品,臨用前用無水乙醇溶解,再加生理鹽水配制,使乙醇的濃度為5%。桿菌肽(bacitracin),Sigma公司產(chǎn)品;β-內(nèi)啡肽放免檢測試劑盒,第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室提供;MHPG及5-HIAA均為Sigma公司產(chǎn)品。動物體重180-230g♂Sprague-Dawly大鼠,購自上海醫(yī)科大學(xué)實驗動物部,光暗周期12/12h(光時相8∶00-20∶00h)的實驗室飼養(yǎng),自由飲食。儀器WQ-9E痛閾測量儀(北京海淀電子醫(yī)療儀器廠);江灣I型腦立體定位儀(上海);恒速灌流泵(B.Braun,德國);SN-696B型γ-計數(shù)儀(中國科學(xué)院上海原子能研究所);微透析系統(tǒng)(CMA,瑞典),其中微透析探頭為BR-2型(BAS,美國);BAS-200A型高效液相色譜電化學(xué)測定系統(tǒng)(美國);Reichert-Jung恒冷切片機(jī)(德國)。痛閾測定大鼠痛閾以WQ-9E痛閾測量儀測定。將針型電極刺入鼠尾近尖端1/3處皮下,施以緩慢連續(xù)增加的直流電刺激,以大鼠開始甩尾時的最小電流強度作為痛閾指標(biāo)。處理前每鼠痛閾測定3次,取均值作為基礎(chǔ)痛閾?；A(chǔ)痛閾在0.15-0.25mA范圍內(nèi)的大鼠用于實驗。推挽灌流實驗在戊巴比妥鈉(40mg·kg-1,ip)麻醉下,大鼠固定于腦立體定位儀上,參照大鼠腦圖譜,定位第三腦室(B:-2.0,L:0,H:8.0),埋植灌流外套管(外徑0.9mm),用502膠和牙托粉泥固定于顱骨表面,術(shù)后注射青霉素鈉防止感染。術(shù)后d3,將大鼠固定在測痛鼠臺上進(jìn)行推挽灌流,將內(nèi)管(外徑0.4mm,末端長出外套管0.5mm)插入外套管,以37℃人工腦脊液恒速(75μL·min-1)灌流。灌流液收集于1.5mL的離心管內(nèi),離心管置于冰浴中,每管預(yù)加桿菌肽150μg以防肽類降解。標(biāo)本于給藥前與給藥后30min至50min各收集一份,儲存于-80℃低溫冰箱以備放免測定。在收集灌流液同時,于給藥前與給藥后40min測定痛閾。灌流結(jié)束后經(jīng)內(nèi)套管(另備)注入約5μL的氨基黑,15min后斷頭取腦切片以鑒定埋管部位是否正確。放射免疫測定用順序飽和法加樣測定推挽灌流液中β-Ep樣免疫活性物質(zhì)(ir-βEp)含量,以二抗沉淀法分離與抗體結(jié)合的[125I]-β-Ep和游離的[125I]-β-Ep,離心去上清液后,沉淀物用SN-695B型γ-計數(shù)儀計數(shù)。以標(biāo)準(zhǔn)品含量的對數(shù)值為橫坐標(biāo),以各管結(jié)合值B與最大結(jié)合值B0之比為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出測定管的ir-βEp含量。腦內(nèi)微透析實驗在戊巴比妥鈉(40mg·kg-1,ip)麻醉下,固定大鼠于腦立體定位儀上,參照大鼠腦圖譜,在PAG腹外側(cè)區(qū)(B:-7.4,L:0.7,H:4.0)、下丘腦(B:-1.8,L:0.8,H:6.4)埋植外套管,抽出外套管內(nèi)芯,插入探頭,探頭長出外套管2.5mm。用人工腦脊液以2μL·min-1恒速灌流,在灌流平衡1h后,收集20min微透析液(40μL),并于給藥后30min至50min再次收集微透析液(40μL),保存于-80℃低溫冰箱。本BR-2型探頭的有效透析長度為2mm,灌流速度為2μL·min-1時MHPG,5-HIAA的相對回收率分別為12.8%,9.9%。微透析結(jié)束后,用1μL微量注射器(末端與探頭等長)注射氨基黑0.5μL,半小時后斷頭取腦切片,以鑒定埋管位置。高效液相色譜-電化學(xué)測定高效液相色譜-電化學(xué)檢測法測定腦微透析液MHPG,5-HIAA的含量。C18反相色譜柱。流動相(pH3.2)成份:D-樟腦-β-磺酸(7.5mmol·L-1),EDTA(2.2mmol·L-1),氯乙酸(0.15mol·L-1),甲酸(10%)。用前先將流動相真空抽濾。流動相以1mL·min-1的速度流經(jīng)色譜柱。檢測電極為玻碳電極,參比電極為Ag/AgCl電極,工作電壓為700mV。腦微透析液樣品直接進(jìn)樣20μL。MHPG,5-HIAA含量計算由系統(tǒng)內(nèi)部程序完成。統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果采用xˉ±sxˉ±s表示,兩組間的顯著性比較采用t檢驗。結(jié)果1u3000酸鈉對大鼠的毒力實驗大鼠分為給藥組(n=5)及對照組(n=3),分別ip給予MLT110mg·kg-1、配藥液(5%乙醇生理鹽水),于給藥前及給藥后30min至50min收集第三腦室推挽灌流液,并在收集灌流液同時測定大鼠痛閾。結(jié)果顯示,對照組大鼠ip配藥液處理前后灌流液中ir-βEp含量無明顯變化,而給藥組大鼠ipMLT后灌流液中ir-βEp含量則顯著高于給藥前水平;給藥處理前兩組灌流液中ir-βEp含量差異無顯著意義,給藥處理后MLT處理組ir-βEp含量則顯著高于對照組(表1),提示MLT可提高第三腦室推挽灌流液中β-Ep含量。同時觀察到ip給予MLT后第40min,大鼠痛閾顯著升高(表2)。Theperfusatewascollectedbeforeand30-50minaftertheadministrationofmelatonin(110mg·kg-1,ip)orvehicle.Datawerepresentedasxˉ±s.?P<0.05vsxˉ±s.*Ρ<0.05vsvehicle-treatedgroup;+P<0.05vsbeforetreatmentThepainthresholdwasmeasuredbeforeand40minafteradministrationofmelatonin(110mg·kg-1,ip)orvehicle.Datawerepresentedasxˉ±s.***P<0.001vsxˉ±s.***Ρ<0.001vsvehicle-treatedgroup;++P<0.01vsbeforetreatment2pag微透析液的制備實驗大鼠分為給藥組(n=7)、對照組(n=6),分別ip給予MLT110mg·kg-1、配藥液,于給藥前及給藥后30min至50min收集PAG微透析液。結(jié)果顯示,MLT對PAG微透析液中MHPG,5-HIAA的含量無顯著影響(P>0.05)(表3)。3methole-pcr合作型同上實驗方案,結(jié)果表明MLT對下丘腦微透析液中MHPG,5-HIAA的含量無顯著影響(P>0.05),見表4。Themicrodialysatewascollectedbeforeand30-50minafteradministrationofmelatonin(110mg·kg-1,ip)orvehicle.Datawerepresentedasxˉ±sxˉ±s.Thereisnosignificantdifferencebetweenthegroups.MHPG:3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol;5-HIAA:5-hydroxyindoleaceticacidThemicrodialysatewascollectedbeforeand30-50minafteradministrationofmelatonin(110mg·kg-1,ip)orvehicle.Datawerepresentedasxˉ±sxˉ±s.Thereisnosignificantdifferencebetweenthegroups.MHPG:3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol;5-HIAA:5-hydroxyindoleaceticacidmlt主要作用于內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)我們先期工作采用大鼠電刺激嘶叫法、熱水刺激甩尾法測定痛閾,分別觀察到ipMLT45-105mg·kg-1,30-120mg·kg-1可產(chǎn)生劑量依賴性鎮(zhèn)痛效應(yīng),給藥后15-20min起效,30-40min達(dá)最大效應(yīng)?；谝陨瞎ぷ?本研究選擇ipMLT110mg·kg-1,觀察給藥后30-50min腦內(nèi)推挽灌流液或微透析液內(nèi)ir-βEp,MHPG,5-HIAA含量的變化,以了解MLT發(fā)揮顯著鎮(zhèn)痛效應(yīng)時腦內(nèi)β-Ep,NE,5-HT釋放的變化。本文結(jié)果顯示,ipMLT110mg·kg-1后40min,大鼠痛閾顯著升高,其時第三腦室推挽灌流液中ir-βEp含量顯著升高,提示MLT可促進(jìn)腦內(nèi)β-Ep的釋放。Xu等報道,ipMLT30min后取腦測定β-Ep,可見下丘腦組織β-Ep含量顯著降低,可能系MLT促進(jìn)β-Ep釋放而引起組織含量降低,這與本研究結(jié)果是吻合的。因此,MLT可促進(jìn)腦內(nèi)β-Ep的釋放,作用于內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng),可能是其鎮(zhèn)痛作用的機(jī)理之一。此外,β-Ep前體為前阿黑皮素(proopiomelanocortin,POMC),據(jù)反饋調(diào)節(jié)原則,腦內(nèi)β-Ep釋放的增加將促進(jìn)其前體POMC的合成,而POMC合成的增加必然依賴于POMCmRNA表達(dá)加強。我們新近工作表明,MLT可加強下丘腦弓狀核內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的POMCmRNA表達(dá),這從另一角度為MLT促進(jìn)腦內(nèi)β-Ep的釋放提供了有力佐證。同時,MLT加強POMCmRNA表達(dá)可彌補因β-Ep的釋放增加而導(dǎo)致POMC的損失,這有利于MLT持續(xù)給藥發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。腦微透析技術(shù)為近年來發(fā)展起來的在體化學(xué)采樣技術(shù),它與高靈敏度的微量化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合,可測定腦內(nèi)細(xì)胞外環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的含量,與同類方法如推挽灌流法比較,對組織損傷小,而且組織不與透析液直接接觸,大大減少了樣品中雜質(zhì)對微量物質(zhì)測定的干擾,因此是神經(jīng)科學(xué)研究中的一項重要技術(shù)。本文采用腦微透析技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法,了解MLT對PAG、下丘腦內(nèi)NE、5-HT釋放的影響。鑒于在本實驗條件下,NE、5-HT相對回收率低(分別為0.88%,0%),不穩(wěn)定,而其主要代謝產(chǎn)物MHPG、5-HIAA較穩(wěn)定,檢測率高,故以微透析液中MHPG,5-HIAA含量的變化作為指標(biāo),間接反映NE,5-HT的變化。結(jié)果顯示,ipMLT110mg·kg-1后30-50minPAG、下丘腦微透析液內(nèi)MHPG,5-HIAA含量均無顯著變化,提示MLT在鎮(zhèn)痛劑量下發(fā)揮顯著鎮(zhèn)痛效應(yīng)時對PAG、下丘腦內(nèi)NE、5-HT的釋放可能無顯著影響。Prazosin既是褪黑素受體MT3亞型阻斷劑[TrendsPharmacolSci,1999,20(Suppl):57],也是α1受體阻斷劑,腦內(nèi)NE主要通過α1受體拮抗嗎啡鎮(zhèn)痛和針刺鎮(zhèn)痛。我們新近工作觀察到,側(cè)腦室注射prazosin對MLT(ip)提高大鼠痛閾效應(yīng)無顯著影響,這從另一角度提示MLT的鎮(zhèn)痛作用與中樞NE能系統(tǒng)可能無關(guān)。但是,連續(xù)多次給予MLT對腦內(nèi)