高效和高靈敏度的蛋白質(zhì)分離分析

高效和高靈敏度的蛋白質(zhì)分離分析

蛋白質(zhì)是生命水體的主要組成要素，在生活發(fā)育的各個(gè)階段都起著重要作用。同時(shí),蛋白質(zhì)產(chǎn)品在食品、藥品、醫(yī)學(xué)診斷及生物催化等領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用。因此,進(jìn)行蛋白的高效率和高靈敏度的分離和分析研究是現(xiàn)代藥物分析、分析化學(xué)及生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。由于蛋白質(zhì)的大小、形狀、電荷、疏水性功能等特性不同,加上現(xiàn)代高新工程技術(shù)的發(fā)展,就為蛋白質(zhì)的分離和分析提供了多種方法。從傳統(tǒng)的離心、沉淀、結(jié)晶方法,發(fā)展到雙水相萃取、反膠團(tuán)萃取、膜分離以及色譜分離技術(shù)。近年來,一些新型的蛋白分離技術(shù)如蛋白質(zhì)色譜、nano-液相色譜等以及多種分離方法的集成聯(lián)用正在不斷涌現(xiàn)出來。本文就蛋白質(zhì)的現(xiàn)代分離分析技術(shù)作一簡要的綜述。1現(xiàn)代鉻技術(shù)1.1水及金屬離子分離高效液相色譜是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次的交換過程,它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親合力、吸附能力、離子交換或分子大小不同引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)進(jìn)行分離。其中,反相高效液相色譜(RP-HPLC)是目前HPLC分離中最常用的一種模式,其特點(diǎn)是固定相的極性小于流動(dòng)相的極性。蛋白質(zhì)分子因其疏水性的不同,使其在兩相中的分配不同而得以分離。低pH值流動(dòng)相、室溫或較高的溫度以及使用乙腈或異丙醇作為有機(jī)部分,三氟乙酸(TFA)作為離子對(duì)試劑更有利于蛋白質(zhì)的分離。蛋白質(zhì)的保留指數(shù)和選擇性還與鍵合固定相的性質(zhì)有關(guān),大孔硅膠(20~30nm)短鏈烷基(C4和C8)鍵合固定相適合于蛋白質(zhì)的分離;分子量相差較大和疏水性很強(qiáng)的蛋白質(zhì)混合物用無孔徑載體柱分離效果很好,較高的柱溫還能改善蛋白質(zhì)混合物的分離。JanineBMills等利用反相高效液相色譜法一步純化完整細(xì)胞中的重組體蛋白;SandraSantiago-Rivas等利用高效液相色譜法分離純化了蚌中的金屬硫蛋白。1.2離子交換色譜填料基質(zhì)IEC是分離和檢測(cè)蛋白質(zhì)的一種重要方法。蛋白質(zhì)分子和離子交換劑(即固定相)之間的相互作用主要是靜電作用,蛋白質(zhì)分子在一定離子強(qiáng)度和pH值條件下所帶電荷不同,介質(zhì)表面的可交換離子和與其帶相同電荷的蛋白質(zhì)分子發(fā)生交換,利用蛋白質(zhì)分子交換能力的差別使蛋白質(zhì)分子混合物得以分離。離子交換劑分為陰離子交換劑和陽離子交換劑兩大類。陰離子交換劑本身帶堿性基團(tuán),蛋白質(zhì)分子在高于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境下帶負(fù)電荷,則可以與陰離子交換劑發(fā)生交換;陽離子交換劑本身帶酸性基團(tuán),蛋白質(zhì)分子在低于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境下帶正電荷,則可以與陽離子交換劑發(fā)生交換。離子交換色譜填料常以多糖、硅膠和有機(jī)聚合物作為基質(zhì)。多糖類基質(zhì)與蛋白質(zhì)有很好的生物相容性,產(chǎn)品回收率高,但是基質(zhì)較軟,只能在低壓下使用;硅膠類基質(zhì)硬度大,適合中高壓色譜,但是硅膠的非特異性吸附,會(huì)使蛋白質(zhì)分子發(fā)生不可逆吸附甚至變性,回收率低,而且硅膠適用的pH范圍較窄(pH2~7.5),因此使用受到限制;有機(jī)聚合物基質(zhì)較硅膠化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,適合在pH2~12范圍內(nèi)的流動(dòng)相中使用,其硬度較多糖類高,適合在中高壓色譜下快速分離,而且親水性強(qiáng),減少了蛋白質(zhì)分子與固定相非特異性結(jié)合的機(jī)會(huì),提高了產(chǎn)品的回收率。HirokiTsukamoto等利用凝血酶和離子交換色譜成功分離純化了融合蛋白。1.3凝膠過濾色譜法凝膠色譜法又稱空間排阻色譜法、分子排阻色譜法,根據(jù)被分離組分分子的線團(tuán)尺寸而進(jìn)行分離。其固定相是多孔性凝膠。按照流動(dòng)相的不同,凝膠色譜可分為兩類:以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相稱為凝膠滲透色譜法(gelpermeationchromatography,GPC);以水溶液為流動(dòng)相者稱為凝膠過濾色譜法(gelfiltrationchromatography,GFC)。凝膠色譜法的分離機(jī)制只取決于凝膠的孔徑大小和被分離組分線團(tuán)尺寸之間的關(guān)系,與流動(dòng)相的性質(zhì)無關(guān)。當(dāng)樣品加于凝膠柱后,較大的分子不能通過孔道進(jìn)入凝膠珠體內(nèi)部,而先隨流動(dòng)相流出層析柱;較小的分子可完全滲入凝膠內(nèi)部,而在大分子之后隨流動(dòng)相流出層析柱。從而使大小不同的分子得以分離。凝膠色譜法是分離生物大分子如蛋白質(zhì)分子的一種重要方法。其所用的填料通常是具有適合孔徑的有機(jī)聚合填料如交聯(lián)瓊脂糖、高分子聚合微球等。然而人們更關(guān)注的是無機(jī)填料,尤其是球形硅質(zhì)填料,由于它具有良好的機(jī)械強(qiáng)度及穩(wěn)定性而被廣泛使用。TugbaBayram等利用凝膠色譜分離了乳清蛋白中的抗氧化活性成分。1.4單一的分離技術(shù)親和色譜是利用偶聯(lián)了親和配基的載體作為固定相來親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物,使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相色譜法。蛋白質(zhì)在行使功能時(shí)必須和底物、受體或抑制劑等分子進(jìn)行生物專一性結(jié)合,親和色譜分離蛋白質(zhì)分子就是利用這種高度專一結(jié)合的特性。親和色譜是蛋白質(zhì)檢測(cè)中最專一的分離技術(shù),可以從復(fù)雜的混合物中直接分離出目標(biāo)蛋白質(zhì)分子。親和色譜固定相的載體是小粒徑的剛性或半剛性的惰性物質(zhì),多孔硅膠是使用最廣的剛性載體,還有苯乙烯-二乙烯基苯的聚合物多孔微球等。配基可分為生物特效性配基和基團(tuán)配基兩大類。有生物專一性作用的體系,如抗體-抗原、酶-底物、激素-受體等的任何一方都可以鍵合在載體上,充當(dāng)親和配基,使另一方得以分離。免疫親和色譜、金屬離子親和色譜和擬生物親和色譜等都成為分離純化蛋白質(zhì)很有效的方法。AC既可以分離純化酶、抗體、抗原、結(jié)合蛋白、受體蛋白、輔助蛋白等,也可以分離變性蛋白、化學(xué)改性蛋白等,在蛋白質(zhì)化學(xué)中有著重要作用。Chalabi等利用親和色譜對(duì)番茄紅素治療后的腫瘤細(xì)胞中的BRCAlandBRCA2蛋白進(jìn)行了定量分析;LindaB.McGown等利用親和色譜蛋白質(zhì)捕獲技術(shù)分離了凝血酶。1.5疏水相互作用色譜法分離和凈化個(gè)人信息疏水相互作用色譜法是利用樣品中各組份與色譜填料上配基相互作用力的差異,在洗脫時(shí)由于各組份移動(dòng)速度的不同而達(dá)到分離的目的。配基通常是一些疏水性基團(tuán),如丁基、苯基等。其分離機(jī)制類似于反相液相色譜,只是用水性緩沖液代替了有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)表面多由親水性基團(tuán)組成,也有一些由疏水性較強(qiáng)的氨基酸(如亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等)組成的疏水性區(qū)域。不同種類蛋白質(zhì)的表面疏水性區(qū)域多少不同,疏水性強(qiáng)弱也不同;對(duì)于同一種蛋白質(zhì)在不同介質(zhì)中,其疏水性區(qū)域(裂隙)伸縮程度也不同,從而使疏水性基團(tuán)暴露的程度呈現(xiàn)出一定的差異。在高鹽環(huán)境下,蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域暴露,固定相表面修飾了一些疏水的基團(tuán),這樣蛋白質(zhì)的疏水部分即可與固定相發(fā)生較強(qiáng)的疏水相互作用,從而被結(jié)合在固定相表面,而一旦降低流動(dòng)相的鹽濃度即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的洗脫。疏水相互作用色譜法正是利用鹽-水體系中樣品組份的疏水性基團(tuán)和色譜填料的疏水性配基相互作用力的不同而使樣品組份得以分離的。該方法彌補(bǔ)了HPLC難以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離的不足。方便易行,是蛋白質(zhì)分離的常用手段之一。KouheiTsumoto等利用疏水相互作用色譜分離了人類白細(xì)胞間介素-6。1.6hsccc-雙水相體系HSCCC利用了一種特殊的流體動(dòng)力學(xué)(單向流體動(dòng)力學(xué)平衡)現(xiàn)象,使兩個(gè)互不相溶的溶劑相在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管中單向分布。其中一相作固定相,由恒流泵輸送載著樣品的流動(dòng)相穿過固定相,利用樣品在兩相中分配系數(shù)的不同實(shí)現(xiàn)分離。高速逆流色譜技術(shù)是一種無固體載體的連續(xù)液-液色譜技術(shù),與其他分離手段相比,HSCCC最大的特點(diǎn)是固定相不用固相載體,克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染和峰形拖尾等缺點(diǎn)。并且具有分離純度高、樣品回收率高、適用范圍廣、可一步制備純品等優(yōu)點(diǎn)。近年來,隨著儀器設(shè)備的不斷改進(jìn)和完善,HSCCC設(shè)備的保留能力和分離性能極大提高,使其能采用雙水相體系進(jìn)行生物大分子如蛋白質(zhì)分離和純化。雙水相體系(Aqueoustwophasesystem,ATPS)是指某些高聚物之間或高聚物與無機(jī)鹽之間在水中以適當(dāng)?shù)臐舛热芙舛纬傻幕ゲ幌嗳艿膬伤嗳軇w系。最常用的體系有聚乙二醇(PEG)-磷酸鹽水溶液體系和聚乙二醇(PEG)-葡聚糖(DEX)水溶液體系。TiingYu等利用反相膠束溶劑系統(tǒng)分離了肌紅蛋白、細(xì)胞色素和球蛋白G。1.7組分分離單元1995年,今板藤太郎等發(fā)表的論文,標(biāo)志著一個(gè)全新的色譜分離技術(shù)的誕生。光色譜是以激光的輻射壓力作為色譜分離的動(dòng)力,在溶液介質(zhì)中含有不同粒徑的粒子,由于它們的大小及折光指數(shù)不同,所受到的激光壓力不同,因而停留在毛細(xì)管不同的位置,從而實(shí)現(xiàn)組分(或粒子)按幾何尺寸大小的分離。光色譜首次將激光技術(shù)引入分離科學(xué)領(lǐng)域,提供了一種用于研究微米區(qū)域內(nèi)粒子的物理化學(xué)及生物學(xué)特性的全新方法,給人們分離和研究生物大分子提供了強(qiáng)有力的手段,使人們有可能從復(fù)雜的基體中分離出單個(gè)大分子并進(jìn)行研究。1.8膜色譜的應(yīng)用膜色譜是將液相色譜和膜分離技術(shù)相結(jié)合的一種新分離技術(shù),既克服了傳統(tǒng)液相色譜介質(zhì)剛性不夠、易被壓縮、不易獲得較高的處理速度、吸附柱容易污染堵塞等缺點(diǎn),又解決了膜分離技術(shù)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)大小相近的混合物無法分離的問題。膜色譜融合了二者之長,具有快速、高效、高選擇性、易于放大等特點(diǎn),能滿足生物大分子高效分離與純化的需要,在生物大分子的分離與純化中已日益受到人們的重視,必將得到廣泛的應(yīng)用。根據(jù)配基與目標(biāo)蛋白的相互作用方式,膜色譜可分為四類:親和膜色譜(AffinityMembraneChromatography,AMC)、離子交換膜色譜(Ion-exchangeMembraneChromatography,IMC)、疏水作用膜色譜(HydrophobicInteractionMembraneChromatography,HIMC)和多級(jí)膜色譜(MultistageMembraneChromatography,MMC)。1.9pflc的應(yīng)用蛋白質(zhì)折疊液相色譜(Proteinfoldingliquidchromatography,PFLC)是近年來發(fā)展起來的一種新技術(shù),廣泛的用于分子生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域,此技術(shù)通過液相色譜法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行重折疊,可以在蛋白質(zhì)折疊復(fù)性的同時(shí)純化蛋白質(zhì)。PFLC包括體積排阻色譜(SEC)、疏水相互作用色譜(HIC)、離子交換色譜(IEC)和親和色譜(AFC)四種模式。因?yàn)樽冃缘鞍踪|(zhì)與SEC固定相無明顯相互作用,而與其他三種模式均有相互作用,PFLC的作用機(jī)制可以從SEC和吸附色譜兩方面進(jìn)行討論。SEC模式利用變性蛋白質(zhì)的半徑大于變性劑的特點(diǎn),使變性蛋白質(zhì)的洗脫速度快于變性劑,是變性蛋白質(zhì)周圍的變性劑逐漸減少,使蛋白質(zhì)逐步折疊,直到半徑不再改變,從而被分離。吸附色譜模式則是利用重折疊蛋白質(zhì)與未折疊蛋白質(zhì)在固定相上的吸附性不同帶到分離的目的。XinduGENG等利用PFLC分離了人類白細(xì)胞干擾素-γ。A蛋白色譜(ProteinAchromatography)是利用葡萄球菌蛋白A(StaphylococcalproteinA(SPA))與免疫球蛋白的親和力,主要用來分離純化抗體的一種色譜技術(shù)。SPA是最早被發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白結(jié)合分子之一,在過去的十年里被廣泛的研究。因?yàn)镾PA與免疫球蛋白有很好的親和力,所以其作為檢測(cè)和純化抗體的工具被大量應(yīng)用,并且被進(jìn)一步發(fā)展成為應(yīng)用最廣的親和純化系統(tǒng)。XuejunHan等利用proteinAchromatography分離了Fc融合蛋白。2聯(lián)動(dòng)儀器的串聯(lián)操作在現(xiàn)代分析化學(xué)領(lǐng)域中,任何儀器的性能都有其局限性。為了解決復(fù)雜的分析問題,常常需要將兩種或兩種以上的獨(dú)立分析儀器串聯(lián)起來,進(jìn)行聯(lián)用操作,以達(dá)到高效、高通量和高靈敏度分析和檢測(cè)的目的。2.1光譜與光譜的聯(lián)合技術(shù)色譜/光譜的聯(lián)用在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用主要包括液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳/質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜/核磁共振聯(lián)用等技術(shù)。2.1.1蛋白-lc-ms聯(lián)用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù),是近年來研究的熱點(diǎn),通過質(zhì)譜可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的自動(dòng)分離檢測(cè)。隨著電噴霧(ESI)接口技術(shù)的發(fā)展,HPLC-ESI-MS聯(lián)用技術(shù)為蛋白質(zhì)的檢測(cè)提供了強(qiáng)有力的工具。這種技術(shù)耗樣量少、精確度高、快速方便,并且可以用于不純或者復(fù)雜混合物的分析。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的多維蛋白鑒定技術(shù)(multi-dimensionalproteinidentificationtechnology,MUDPIT)是先將蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行酶切(可以用一種酶切或幾種酶同時(shí)切)得到混合肽段,然后通過強(qiáng)離子交換反相色譜柱進(jìn)行多次分離并連用LC-MS/MS分析肽段,并且通過同位素標(biāo)記肽段的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)蛋白定量分析。YujiIshii等利用HPLC-MS分離蛋白質(zhì)和組織中的硝化色氨酸。目前,越來越多的注意力轉(zhuǎn)向了微量液相色譜系統(tǒng),這種小型化的液相色譜系統(tǒng)有著比傳統(tǒng)高效液相色譜更高的靈敏度。保持其他參數(shù)不變,通過減小色譜柱的直徑就可以增加系統(tǒng)的靈敏度。據(jù)報(bào)道,當(dāng)色譜柱的直徑從4.6mm減小至0.100mm,色譜系統(tǒng)的靈敏度將增加大約2000倍。Nano-liquidchromatography(nano-LC)的色譜柱直徑在10~150μm之間,流速10~1000nL·min-1。和傳統(tǒng)高效液相色譜技術(shù)相比,nano-LC有更高的分離效率,更高的靈敏度,同時(shí)減少了流動(dòng)相的用量和損耗。但是,nano-LC由于很小的柱容積,使得其進(jìn)樣量很小,只有10nL左右,因此不能達(dá)到很高的靈敏度。Nano-LC-MS聯(lián)用可以解決這個(gè)問題,相對(duì)較低的流速可以使分離系統(tǒng)的聯(lián)用更加簡單。當(dāng)電噴霧(ESI)接口技術(shù)作為恒流離子技術(shù)用于nano-LC-MS聯(lián)用,流速的降低可以增加氣態(tài)相中離子的數(shù)目,從而增加了分離系統(tǒng)的靈敏度。nano-LC-MS聯(lián)用技術(shù)在分離蛋白質(zhì)、多肽等大分子領(lǐng)域已經(jīng)有較為廣泛的應(yīng)用。HanyFarwanah等利用LC/APCI-MS和Nano-ESI-MS/MS分離了共價(jià)結(jié)合的皮膚神經(jīng)酰胺。2.1.2ce-ms聯(lián)用系統(tǒng)與LC-MS相比,CE-MS聯(lián)用技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用尚處于起步階段,但是此聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)其他選擇性較差的檢測(cè)系統(tǒng),如紫外檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器等,起到了較強(qiáng)的補(bǔ)充作用,因?yàn)镃E-MS聯(lián)用系統(tǒng)可以使復(fù)雜混合物中的被分離成分根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)而被表征。最常見的毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用模式是CZE-MS。CE-MS聯(lián)用技術(shù)的關(guān)鍵問題是CE與MS的接口問題,常見的分離蛋白質(zhì)等大分子的聯(lián)用接口技術(shù)有CE-ICP-MS,CE-ESI-MS等。在對(duì)復(fù)雜生物樣品進(jìn)行分析時(shí),僅僅依靠CE-MS顯然是不夠的,必須加強(qiáng)預(yù)分離措施,常用的方法即是結(jié)合HPLC分離。VictoriaSanz-Nebot等利用毛細(xì)管電泳/質(zhì)譜聯(lián)用分離了阿片樣多肽。2.1.3定的局限性液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)和核磁共振光譜(NMR)是兩種較為突出的技術(shù)手段,但在單獨(dú)使用時(shí)都具有一定的局限性。而液相色譜-核磁共振光譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(LC-NMR-MS)在單獨(dú)的LC分離后,同時(shí)獲得MS和NMR數(shù)據(jù)。MS對(duì)化合物進(jìn)行快速掃描,提供初步的結(jié)構(gòu)信息;NMR作為輔助,進(jìn)行詳細(xì)的結(jié)構(gòu)解析,提供了一種實(shí)時(shí)復(fù)合矩陣分析的模式。AnneKruseLykkeberg等用LC-MS-NMR分離了豬肝微粒體中硫姆林代謝產(chǎn)物。2.2毛細(xì)管區(qū)帶電泳和hplc聯(lián)用分離蛋白質(zhì)HPLC-CE聯(lián)用技術(shù)特別適合細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的分離。在分離檢測(cè)復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品時(shí),HPLC-CE可以作為HPLC的補(bǔ)充,有時(shí)可很好地分離利用HPLC無法分離的蛋白質(zhì)。毛細(xì)管區(qū)帶