流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)鄰苯三酚自由基的研究

流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)鄰苯三酚自由基的研究

大多數(shù)人類疾病，如心腦血管疾病、癌癥和早老性愚蠢，與體內(nèi)負(fù)荷自由基有關(guān)。功能食品的研制以及天然抗氧化劑的開發(fā)對(duì)清除體內(nèi)過(guò)剩的自由基,保護(hù)人體健康有著重要的意義。建立一種簡(jiǎn)單、有效的抗氧化評(píng)價(jià)方法,有助于正確評(píng)價(jià)和篩選抗氧化劑,并可以應(yīng)用于功能食品的研制和開發(fā)中。本文采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光技術(shù),分別在鄰苯三酚自氧化體系和由Fe2+催化的Fenton體系中,考察了實(shí)驗(yàn)條件的變化對(duì)化學(xué)發(fā)光的影響,并優(yōu)化了檢測(cè)和·OH的化學(xué)發(fā)光體系,檢測(cè)了抗壞血酸和硫脲對(duì)兩種自由基的清除。結(jié)果表明,上述兩個(gè)體系對(duì)檢驗(yàn)和·OH具有簡(jiǎn)單、快速和重復(fù)性好的特點(diǎn)。1材料和方法1.1酶活劑鄰苯三酚溶液用1×10-3mol/L的HCI溶液配制,使用前用二次蒸餾水稀釋至所需濃度;魯米諾購(gòu)自Sigma公司,用0.1mol/L的NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液配制成所需濃度;亞鐵氰化鉀、魯米諾以及H2O2均用KH2PO4-NaOH(pH=7.20)緩沖溶液配制,使用前配制;硫脲、抗壞血酸(Vc)、甘露醇、苯甲酸鈉等試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。IFFM-D型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀西安瑞邁科技有限公司。1.2羥基自由基oh體系流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光流程如圖1所示,蠕動(dòng)泵分別泵入魯米諾、緩沖溶液以及鄰苯三酚(羥基自由基·OH體系中,蠕動(dòng)泵分別泵入魯米諾、亞鐵氰化鉀溶液以及H2O2溶液)。在流通池中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,記錄發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度,以峰面積定量。整個(gè)分析過(guò)程和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集及處理均由Windows98系統(tǒng)下設(shè)備自帶的rema×軟件完成。1.3清除劑溶液的配制自由基清除劑用緩沖液配制,測(cè)定時(shí),待空白峰面積穩(wěn)定后,依次換上從稀到濃的自由基清除劑溶液。每個(gè)稀釋樣品測(cè)三個(gè)峰,結(jié)束進(jìn)液,將峰面積讀出,對(duì)自由基的清除效率S由下式計(jì)算:其中:A0、Ai分別為加入自由基清除劑前后體系的化學(xué)發(fā)光峰面積。2結(jié)果與討論2.1發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)定鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生超氧陰離子自由基,超氧陰離子自由基與化學(xué)發(fā)光增效劑魯米諾(Luminol,3-氨基鄰苯二甲酰肼)反應(yīng),使之氧化,產(chǎn)生一個(gè)電子激發(fā)態(tài)的中間物,當(dāng)其返回基態(tài)時(shí),可發(fā)出化學(xué)冷光,用發(fā)光檢測(cè)裝置即可測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。反應(yīng)體系中的超氧陰離子自由基的量可以用化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度來(lái)相對(duì)表示。分別考察鄰苯三酚、魯米諾和體系pH對(duì)化學(xué)發(fā)光的影響,以發(fā)光的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度為依據(jù),確定超氧陰離子自由基的檢測(cè)條件。2.1.1鄰苯三酚對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響考察鄰苯三酚溶液對(duì)體系發(fā)光情況的影響,以其濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光峰面積作圖,得圖2?？芍?鄰苯三酚濃度從1×10-6增加到1×10-4mol/L時(shí),體系的發(fā)光強(qiáng)度從2000急劇增至13000,實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差。同時(shí)可知,在該濃度范圍內(nèi),鄰苯三酚濃度微小的變化會(huì)引起發(fā)光值的巨大波動(dòng);當(dāng)鄰苯三酚濃度在1×10-4～5×10-4mol/L范圍內(nèi)變化時(shí),發(fā)光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定,保持在13000～10000之間,且實(shí)驗(yàn)的平行性良好;而鄰苯三酚濃度繼續(xù)增加,發(fā)光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì),且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性降低。故而鄰苯三酚溶液濃度選擇為:3×10-4mol/L。2.1.2魯米諾濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響當(dāng)鄰苯三酚濃度為3×10-4mol/L,體系pH為10.2時(shí),考察魯米諾濃度的改變對(duì)化學(xué)發(fā)光的影響。由圖3可知,當(dāng)魯米諾的濃度從0.003mmol/L增大到0.3mmol/L時(shí),發(fā)光強(qiáng)度急劇增大;當(dāng)魯米諾濃度繼續(xù)增加,從0.3mmol/L增大到1.0mmol/L時(shí),發(fā)光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定,發(fā)光值約保持在40000左右。但當(dāng)體系中的魯米諾濃度繼續(xù)增大,體系的發(fā)光強(qiáng)度明顯降低,且實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性較差。綜上,體系中魯米諾溶液濃度為0.6mmol/L。2.1.3體系的發(fā)光強(qiáng)度當(dāng)鄰苯三酚濃度為3×10-4mol/L、魯米諾溶液濃度為0.6mmol/L的情況下,改變體系的pH,考察其對(duì)體系化學(xué)發(fā)光的影響,得圖4。pH是從兩個(gè)方面影響發(fā)光強(qiáng)度的。一方面,pH影響魯米諾的發(fā)光,從這一角度看,增大體系pH有利于提高發(fā)光強(qiáng)度。同時(shí),pH影響鄰苯三酚自氧化的速率。當(dāng)pH從8.5上升至9.3時(shí),體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度幾乎難于察覺(jué);當(dāng)pH繼續(xù)上升至10.2時(shí),體系的化學(xué)發(fā)光值驟然達(dá)到60000左右,且重復(fù)性良好;而當(dāng)pH繼續(xù)增大時(shí),體系的發(fā)光強(qiáng)度雖然有所增加,但同時(shí)平行實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性大大下降,即過(guò)高的自氧化速率使體系的化學(xué)發(fā)光處于不穩(wěn)定的狀態(tài),從而影響實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。故而將體系的pH選定為10.20。2.2魯米諾體系增強(qiáng)劑羥基自由基·OH由Fe2+催化的Fenton體系產(chǎn)生,魯米諾為發(fā)光增效劑?？疾旆磻?yīng)物和魯米諾的濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度、穩(wěn)定性以及重現(xiàn)性的影響,得到檢測(cè)羥基自由基·OH的條件。2.2.1魯米諾對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響當(dāng)體系中過(guò)氧化氫濃度為1.0mol/L,亞鐵氰化鉀濃度為1mg/mL時(shí),考察魯米諾濃度的變化對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。由圖5可知,隨著魯米諾濃度的增加,體系的化學(xué)發(fā)光值幾乎從無(wú)到有,呈逐漸增大的趨勢(shì),這表明體系的化學(xué)發(fā)光依賴于魯米諾的存在。而當(dāng)魯米諾濃度達(dá)到0.18mg/mL時(shí),發(fā)光值達(dá)到較大值,并且趨于一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)。本體系中,最終選擇的魯米諾濃度為0.14mg/mL。2.2.2過(guò)氧化氫濃度對(duì)產(chǎn)品發(fā)光強(qiáng)度的影響當(dāng)魯米諾濃度定為0.14mg/mL,亞鐵氰化鉀濃度為1mg/mL時(shí),考察H2O2濃度的變化對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響,得圖6。當(dāng)過(guò)氧化氫濃度從0.05mol/L增大到0.8mol/L的過(guò)程中,體系的化學(xué)發(fā)光值隨著過(guò)氧化氫濃度的增大而激增,過(guò)氧化氫濃度在0.8～1.6mol/L之間時(shí),發(fā)光值基本保持穩(wěn)定。而后隨著過(guò)氧化氫濃度的繼續(xù)增大,發(fā)光強(qiáng)度逐漸減小。這表明體系中若無(wú)過(guò)氧化氫的存在,就沒(méi)有羥基自由基·OH的生成,無(wú)法產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,而過(guò)氧化氫濃度太大,不僅會(huì)抑制發(fā)光,也會(huì)使體系的發(fā)光處于一種不穩(wěn)定的狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中將過(guò)氧化氫的濃度固定為1.2mol/L。2.2.3過(guò)氧化氫濃度對(duì)亞鐵氰化鉀體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響圖7是亞鐵氰化鉀對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響曲線。當(dāng)魯米諾濃度定為0.1419mg/mL,過(guò)氧化氫濃度為1.2mol/L時(shí),亞鐵氰化鉀濃度從0.4mg/mL到1mg/mL增大的過(guò)程中,體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著亞鐵氰化鉀濃度的增大呈線性遞增,而后隨著亞鐵氰化鉀濃度的繼續(xù)上升,化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯下降。本體系中亞鐵氰化鉀濃度確定為1.0mg/mL。2.3抗壞血酸與硫脲對(duì)羥基自由基oh的清除效果圖8為不同濃度Vc和硫脲對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果圖。由圖可知,抗壞血酸和硫脲對(duì)超氧陰離子自由基的半抑制濃度IC50約為0.15和6.5×10-4mg/mL。圖9為不同濃度Vc和硫脲對(duì)羥