豬線蟲病的分離方法

豬線蟲病的分離方法

收集昆蟲尸體是所有寄生蟲學(xué)和研究所需要的。近年來，國內(nèi)外關(guān)于線蟲成蟲相關(guān)基因的研究報(bào)道較多，而對(duì)幼蟲特異性基因的報(bào)道甚少，其主要原因之一是較難獲得大量高純度的幼蟲。尋找分離幼蟲的有效方法將為研究幼蟲發(fā)育的特異基因、開展幼蟲體外培養(yǎng)技術(shù)、進(jìn)行RNA干擾等研究奠定良好的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以豬蛔蟲為模型，對(duì)不同發(fā)育期幼蟲的分離制備方法進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1小鼠5人蛔蟲：從深圳某屠宰場(chǎng)采集。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：由廣東省某種豬場(chǎng)提供20～25kg/只的小豬5只。漏斗：直徑30cm的漏斗數(shù)個(gè)。紗布和分樣篩：醫(yī)用紗布，江蘇常州紅旗紗篩廠產(chǎn)300目、200目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩。玻璃珠：由北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心提供。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1卵粒及感染情況調(diào)查從深圳某屠宰場(chǎng)采集新鮮豬蛔蟲成蟲后，用滅菌生理鹽水清洗數(shù)次；區(qū)分雌雄后，立即解剖雌性成蟲；收集子宮的后1/2段，用滅菌的PBS液在研缽內(nèi)稍加研磨后，加PBS液及1.5%福爾馬林液各清洗、離心2次，棄上清，將沉淀放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)方法：在培養(yǎng)皿上先鋪上一層約0.5cm厚的棉花，在棉花上鋪一層濾紙；將沉淀均勻鋪在濾紙上，并在上面滴數(shù)滴1.5%福爾馬林液，以保持底部棉花的濕潤并起到抗菌作用。蓋上皿蓋，28～30℃溫箱培養(yǎng)30d左右。培養(yǎng)期間，定期添加1.5%福爾馬林液。每隔一周取樣鏡檢觀察蟲卵的發(fā)育情況。約28d后，蟲卵已基本發(fā)育成感染期蛔蟲卵。收集這些感染性蟲卵，于4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2離心柱的制備取部分感染性蟲卵，用40目銅篩過濾，收集濾液于50ml離心管中，加7.5%次氯酸鈉，37℃過夜后，用滅菌的0.9%生理鹽水離心數(shù)次，充分洗去次氯酸鈉，最后將沉淀用1.5ml離心管分裝，加數(shù)粒玻璃珠，并加生理鹽水至剛好淹沒玻璃珠，在振蕩器上振蕩5min至卵殼破裂，幼蟲孵出。用200目分樣篩過濾去除玻璃珠，收集濾液，并按彭國華等報(bào)道的方法進(jìn)行改良后分離濾液中的幼蟲和破裂卵殼。即用淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心法離心濾液后，將濾液分為四層，分別吸取第二層下環(huán)中的幼蟲和底層幼蟲，用生理鹽水洗滌離心2次后，再用淋巴細(xì)胞分離液重復(fù)分離3次，最后收集最底層的脫鞘幼蟲。1.2.3不同規(guī)格瓊脂糖凝膠液的制備用培養(yǎng)的感染期蟲卵感染20～25kg重的小豬4只，分別在感染后3d和7d剖殺2只實(shí)驗(yàn)豬，取其肝和肺，將肝和肺剪成小塊后，用絞肉機(jī)絞碎。采用瓊脂凝膠法按貝爾曼原理分離幼蟲。取9個(gè)直徑30cm的漏斗，下端連接20cm長的橡皮管，在橡皮管下方接一1.5ml的離心管，剪9塊直徑30cm的紗布四層分別放入漏斗內(nèi)，漏斗內(nèi)裝入預(yù)熱38℃的生理鹽水，排出漏斗頸及橡皮管中的氣泡。配制0.5%瓊脂糖凝膠液，冷卻到60℃后，倒入裝有生理鹽水的漏斗中，使其終濃度約為0.3%～0.4%。分別將絞碎的肝肺平均分裝在漏斗中，然后放入40℃溫箱中孵育3h，取下橡皮管下的離心管，靜置5min，吸去1ml的上層液，留下0.5ml沉淀，用400目分樣篩過濾分離肝中的L3，用300目分樣篩過濾分離肺中的L3。1.2.4幼蟲分離和分離用培養(yǎng)的感染性蟲卵感染20～25kg重的小豬3只，在感染后15～18d剖殺實(shí)驗(yàn)豬，取其小腸，收集小腸內(nèi)容物及腸粘膜，按上述收集肺中L3的方法分離幼蟲。通過200目分樣篩過濾，收集L4。2結(jié)果2.1感染l3的制備采用上述次氯酸鈉氧化加玻璃珠震蕩的方法能收集到大量的脫鞘豬蛔蟲感染性L3，且通過淋巴細(xì)胞分離液梯度離心后，能獲得高純度的感染性幼蟲，且活力較強(qiáng)（圖1、2）。2.23和l4觀察通過在漏斗內(nèi)加低濃度的瓊脂凝膠的方法獲得的豬蛔蟲L3及L4純度很好，且活力較強(qiáng)（圖3、4）。3度的研究進(jìn)展寄生線蟲給人和動(dòng)物帶來較為嚴(yán)重的危害，它們?cè)谒拗黧w內(nèi)的移行會(huì)引起一系列的疾病。目前對(duì)寄生線蟲感染還主要依靠藥物治療，但線蟲的抗藥性問題日益突出，而且藥物治療還可導(dǎo)致肉類食品中的藥物殘留及環(huán)境污染問題。因此從研究感染期幼蟲的特異表達(dá)基因著手，可能開辟防制線蟲感染的新途徑，而體外獲得較為純凈的感染期幼蟲是開展這些研究的前提。根據(jù)FAGERHOLM等的最新研究，豬蛔蟲蟲卵內(nèi)的胚胎在卵殼內(nèi)就已經(jīng)過2次蛻皮，并發(fā)育為具有感染性的L3，這種蟲卵感染豬后2～7d內(nèi)在肝和肺中都沒有進(jìn)行第三次蛻皮，最終是在腸道內(nèi)才進(jìn)行第三次蛻皮，發(fā)育為L4和成蟲，所以寄居在肝和肺中的幼蟲都為第三期幼蟲（L3），只是大小有所差異。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)FAGERHOLM等的結(jié)論，除了體外脫鞘收集蟲卵中的感染期L3外，分別從豬肝、肺中收集L3，并在小腸中收集L4進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)通過次氯酸鈉氧化卵殼，再用玻璃珠震蕩，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心去除卵殼的方法能夠分離到大量高純度的感染期幼蟲。相對(duì)于其它方法，本實(shí)驗(yàn)所采用的方法操作簡(jiǎn)便，分離率高（可達(dá)100%），純度好，為大量制備幼蟲提供了快速便捷的方法。有研究認(rèn)為，次氯酸鈉的氧化作用和玻璃珠的機(jī)械作用都會(huì)導(dǎo)致蟲體不同程度的損傷，不利于幼蟲的體外培養(yǎng)。但本實(shí)驗(yàn)中，次氯酸鈉只是氧化卵殼，在卵殼壁被氧化到很薄時(shí)，便通過生理鹽水的大量沖洗以去除次氯酸鈉；接下來的步驟中，幼蟲最后是游離在生理鹽水的環(huán)境中，因此次氯酸鈉應(yīng)該不會(huì)對(duì)其造成氧化作用的損傷；應(yīng)比較用這種方法和其它方法收集的幼蟲在體外培養(yǎng)中的表現(xiàn)及存活情況，但目前尚未見有關(guān)報(bào)道。而基于幼蟲的個(gè)體差異和玻璃珠震蕩的均勻度及時(shí)間的控制等因素，玻璃珠的機(jī)械作用的確會(huì)造成蟲體不同程度的損傷，但對(duì)于幼蟲RNA或DNA的制備，它是一種簡(jiǎn)便快速的方法。采用傳統(tǒng)的貝爾曼氏法分離幼蟲通常伴隨有較多雜質(zhì)，即使采用不同孔徑的分樣篩過濾，也難免會(huì)有與蟲體大小相同的雜質(zhì)不能被過濾掉，因而不能獲得高純度的幼蟲。SLOTVED等和MURRELL等采用終濃度為1%的瓊脂凝膠法將含幼蟲的碎組織凝固，然后浸泡在0.9%生理鹽水中收集幼蟲，也能獲得純度較高的幼蟲，但獲得的蟲體數(shù)量相對(duì)于貝爾曼氏法偏少，這樣不利于一次性獲得大量蟲體，從而增加實(shí)驗(yàn)次數(shù)和成本。本實(shí)驗(yàn)中采用低濃度（0.4%）瓊脂凝膠結(jié)合貝爾曼氏法分離幼蟲的方法，結(jié)果顯示能夠獲得大量高純度的幼蟲