生物技術(shù)制藥

生物技術(shù)制藥一、緒論生物技術(shù)制藥（biotechdrug）：運(yùn)用DNA重組技術(shù)或其它生物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥品。生物藥品（biopharmaceutics）：生物技術(shù)藥品與天然生化藥品、微生物藥品、海洋藥品和生物制品的統(tǒng)稱。生物技術(shù)藥品的特性：①分子構(gòu)造復(fù)雜；②含有種屬特異性；③治療針對(duì)性強(qiáng)、療效高；④穩(wěn)定性差；⑤基因穩(wěn)定性；⑥免疫原性；⑦體內(nèi)的半衰期短；⑧受體效應(yīng)；⑨多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)；⑩生產(chǎn)系統(tǒng)復(fù)雜性以及質(zhì)量控制的特殊性。生物技術(shù)制藥特性：高技術(shù)、高投入、長(zhǎng)周期、高風(fēng)險(xiǎn)、高收益。生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用：基因工程重組蛋白質(zhì)及多肽藥品、基因工程抗體、基因工程疫苗（蛋白質(zhì)）、基因疫苗（核酸）、基因診療、基因治療、動(dòng)植物基因工程藥品……二、基因工程制藥表一基因工程藥品類型舉例免疫性蛋白多個(gè)抗原和單克隆抗體細(xì)胞因子干擾素、白細(xì)胞介素、表皮生長(zhǎng)因子、凝血因子（血友病）蛋白質(zhì)激素胰島素、降鈣素（治療骨質(zhì)疏松）、心鈉素（心臟?。⑸L(zhǎng)激素酶類（尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織型纖溶酶原激活劑）（心梗、腦梗）、SOD基因體現(xiàn)1.1宿主菌的選擇：高濃度、高產(chǎn)量、高產(chǎn)率；原料便宜；不致病、不產(chǎn)內(nèi)毒素；發(fā)熱量低，需氧低，適宜的發(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；易進(jìn)行代謝調(diào)控；易進(jìn)行重組DNA技術(shù)；產(chǎn)物易提純。原核細(xì)胞大腸桿菌枯草芽孢桿菌鏈霉菌優(yōu)點(diǎn)遺傳背景清晰，操作簡(jiǎn)便，體現(xiàn)量大革陽，無致病性，可分泌體現(xiàn)工業(yè)，無致病性，可分泌體現(xiàn)，能對(duì)的折疊，可糖基化缺點(diǎn)無法分泌體現(xiàn)，提取困難；不能糖基化；N端多一種甲硫氨酸殘基；產(chǎn)生內(nèi)毒素；產(chǎn)生蛋白酶不能糖基化，蛋白酶降解產(chǎn)物，體現(xiàn)量低產(chǎn)品胰島素、G-CSF、干擾素α、干擾素β-1b真：白介素-3、乙肝核心抗原、乙肝PreS2抗原；原：甘油激酶、纖維素酶、色氨酸合成酶真核細(xì)胞酵母絲狀真菌優(yōu)點(diǎn)周期短，工藝簡(jiǎn)樸，成本低，能糖基化，能分泌體現(xiàn)工業(yè)，分泌能力強(qiáng)，體現(xiàn)產(chǎn)量高，糖基化方式與真核類似缺點(diǎn)缺少?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子，分泌效率差，過分糖基化，難以高密度發(fā)酵。（釀酒酵母；畢赤酵母，即甲醇營(yíng)養(yǎng)型體現(xiàn)系統(tǒng)）非絲狀真菌蛋白分泌率低，轉(zhuǎn)化效率低，基因背景理解不充足，產(chǎn)物降解產(chǎn)品尿酸水解、胰高血糖素、GM-CSF、胰島素、水蛭素、乙肝疫苗、HPV疫苗（防止宮頸癌）絲狀真菌內(nèi)源性蛋白，如工業(yè)或食用的酶1.2大腸桿菌體系中的基因體現(xiàn)必備條件：①載體能獨(dú)立復(fù)制；②有克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)記；③有強(qiáng)啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識(shí)別；④有阻遏子；⑤強(qiáng)終止子；⑥產(chǎn)生的mRNA含AUG和SD序列。啟動(dòng)子啟動(dòng)子類型特點(diǎn)lac（乳糖操縱子）阻遏蛋白基因（lacI）+啟動(dòng)基因（P）+操縱基因（O）+構(gòu)造基因（Z/Y/A）。負(fù)控誘導(dǎo)Trp（色氨酸）負(fù)控阻遏，色氨酸含量低時(shí)轉(zhuǎn)錄taclac+trpλPL（噬菌體）負(fù)控誘導(dǎo)，溫敏型，30℃時(shí)轉(zhuǎn)錄受阻，45℃時(shí)啟動(dòng)，活性比trp高11倍T7（噬菌體）只有T7RNA聚合酶可啟動(dòng)，可高效體現(xiàn)其它系統(tǒng)不能有效體現(xiàn)的基因影響目的基因在大腸桿菌中體現(xiàn)的因素①體現(xiàn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性②外源基因的體現(xiàn)效率啟動(dòng)子的強(qiáng)弱重要影響因素，轉(zhuǎn)錄水平上影響基因體現(xiàn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD）的有效性SD序列最少含AGGAGG序列中的4個(gè)堿基SD序列和起始密碼子ATG的間距9士3bp密碼子構(gòu)成密碼子偏好性③體現(xiàn)產(chǎn)物的穩(wěn)定性增加蛋白酶作用底物；組建融合基因；加入信號(hào)肽；變化真核蛋白二硫鍵位置；采用缺點(diǎn)型大腸桿菌。④細(xì)胞的代謝負(fù)荷將細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的體現(xiàn)分成兩個(gè)階段。⑤工程菌的培養(yǎng)條件真核基因在大腸桿菌中體現(xiàn)的形式融合蛋白短原核多肽（N）+真核蛋白（C），只作抗原使用，不作注射用藥非融合蛋白細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子-細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）-真核基因的起始密碼子-構(gòu)造基因-終止密碼子?；钚愿撸妆坏鞍酌杆夥置隗w現(xiàn)型蛋白堿性磷酸酶信號(hào)肽（PhoA）、膜外周質(zhì)蛋白信號(hào)肽（OmpA）、霍亂弧菌毒素B亞單位（CTXB）。不含氨基端的甲硫氨酸，產(chǎn)量低，信號(hào)肽不被切割或切割不精確1.3酵母體系中的基因體現(xiàn)外源基因的劑量/拷貝數(shù)外源基因的體現(xiàn)效率①啟動(dòng)子啟動(dòng)子類型所用的基因基因符號(hào)構(gòu)成型磷酸甘油酸激酶PGK3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH乙醇脫氫酶ADH1，ADH2誘導(dǎo)型乙醇氧化酶AOX1半乳糖激酶GAL1②分泌信號(hào)的效率慣用釀酒酵母的A因子信號(hào)（alpha）和畢赤酵母酸性磷酸酶信號(hào)肽。③終止序列的影響ADH1、CYC1、MF1和PGK優(yōu)化基因內(nèi)部構(gòu)造外源蛋白的糖基化可發(fā)生N-糖苷鍵（天冬氨酰連接）和O-糖苷鍵（絲氨酸和蘇氨酸連接）連接的兩種不同的糖基化。制止外源蛋白降解①營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型②添加蛋白酶底物（蛋白胨或酪蛋白水解物）③變化某些培養(yǎng)條件（pH）④突變外源蛋白基因的個(gè)別位點(diǎn)，變化其蛋白質(zhì)序列中蛋白酶的作用部位。選擇適宜的酵母生長(zhǎng)密度基因工程菌的不穩(wěn)定性及對(duì)策2.1質(zhì)粒的不穩(wěn)定性基因工程菌的穩(wěn)定性最少應(yīng)維持25代以上。類型有關(guān)因素分裂不穩(wěn)定質(zhì)粒丟失率（與宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件有關(guān)）；比生長(zhǎng)速率差別構(gòu)造不穩(wěn)定DNA從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失質(zhì)粒穩(wěn)定性分析：通過比較在含有和不含抗生素培養(yǎng)基的菌體存活數(shù)，能夠檢測(cè)質(zhì)粒的丟失率。2.2提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的辦法選擇適宜的宿主菌適宜的載體選擇壓力①構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)加入抗生素抗性基因②用營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型細(xì)胞作為宿主菌分階段控制培養(yǎng)控制培養(yǎng)條件溫度、溶氧、pH、限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、有害代謝產(chǎn)物濃度、培養(yǎng)基組分。固定化大腸桿菌B（pTG201）培養(yǎng)代數(shù)丟失質(zhì)粒的菌體固定細(xì)胞10-20代之后9%游離細(xì)胞85代60%基因工程菌中試工程菌選擇發(fā)酵罐設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基構(gòu)成發(fā)酵工藝優(yōu)化與參數(shù)監(jiān)測(cè)控制重組工程菌的培養(yǎng)4.1基因工程菌的培養(yǎng)方式補(bǔ)料分批培養(yǎng)：溶氧在20%。持續(xù)培養(yǎng)透析培養(yǎng)固定化培養(yǎng)4.2基因工程菌的培養(yǎng)工藝影響因素培養(yǎng)基接種量取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵中的生長(zhǎng)繁殖速度溫度發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或低分子調(diào)節(jié)分子合成等水平上溶解氧DO2（氧輸送）≥40%才干提高工程菌的生長(zhǎng)，利于外源蛋白產(chǎn)生誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時(shí)機(jī)pH生長(zhǎng)：6.8-7.4；體現(xiàn)：6.0-6.54.3基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備發(fā)酵罐規(guī)定：能獲得高濃度的受體細(xì)胞和高體現(xiàn)的基因產(chǎn)物；培養(yǎng)過程不得污染，確保純菌培養(yǎng)；培養(yǎng)及消毒過程不得游離出異物，不能干擾細(xì)菌代謝活動(dòng)。高密度發(fā)酵5.1高密度發(fā)酵（highcell-densityfermentation）:普通指培養(yǎng)液中工程菌濃度在50g干重/L以上，最高值可達(dá)200g干重/L。5.2影響高密度發(fā)酵的因素：培養(yǎng)基、溶氧濃度、pH、溫度、代謝副產(chǎn)物。5.3實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的辦法發(fā)酵條件的改善培養(yǎng)基的選擇建立流加式培養(yǎng)方式提高供氧能力構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌基因工程藥品的分離純化6.1分離純化的基本過程6.2細(xì)胞的破碎辦法物理破碎法高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎法、高壓擠壓法化學(xué)破碎法滲入沖擊、增溶法、脂溶法生物破碎法酶溶法6.3固液分離離心沉淀膜過濾雙水相萃取6.4重組蛋白質(zhì)的分離純化分離純化重要依賴色譜分離法辦法目的離心/過濾去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片、顆粒性雜質(zhì)（如病毒）陰離子交換層析去除雜質(zhì)蛋白、脂質(zhì)、DNA和病毒等40nm微孔濾膜過濾進(jìn)一步去除病毒陽離子交換層析去除牛血清蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白超濾去除沉淀物及病毒疏水層析去除殘存的雜蛋白凝膠過濾與多聚體分離0.22μm微孔濾膜過濾除菌6.5非蛋白類雜質(zhì)的去除DNA的去除目的蛋白pI＞6.0，用陰離子吸附劑吸附DNA目的蛋白為強(qiáng)酸性，用陽離子吸附劑吸附蛋白質(zhì)，而不讓DNA被吸附熱原質(zhì)的去除重要是腸桿菌科所產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分——脂多糖。超濾、滲入、色譜技術(shù)病毒的去除色譜分離、紫外線照射、過濾分離變性蛋白的復(fù)性7.1包含體/包涵體形成因素大腸桿菌高水平體現(xiàn)的重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)聚集而形成不溶的、無活性的固體顆粒。7.2包含體的分離和溶解包含體的分離包含體的溶解普通用強(qiáng)變性劑如脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽，或去垢劑如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物；對(duì)含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇、半胱氨酸；加入金屬螯合劑如EDTA以除去金屬離子；30℃促溶7.3包含體蛋白復(fù)性辦法稀釋、透析復(fù)性法復(fù)性類型特點(diǎn)稀釋直接加水或緩沖液，放置過夜透析通過逐步減少外透液濃度來控制變性劑去除速度超濾在生產(chǎn)中使用較多，規(guī)模較大含二硫鍵的蛋白的復(fù)性封閉蛋白的疏水簇增進(jìn)復(fù)性凝膠過濾層析復(fù)性小分子添加劑增進(jìn)的復(fù)性分子伴侶或折疊酶增進(jìn)的復(fù)性人工分子伴侶增進(jìn)的復(fù)性7.4大腸桿菌的體現(xiàn)產(chǎn)物包含體細(xì)菌收集與破碎包含體的分離、洗滌與溶解變性蛋白質(zhì)的純化重組蛋白質(zhì)的復(fù)性天然蛋白質(zhì)的分離分泌型的體現(xiàn)產(chǎn)物體積大、濃度低、需濃縮：沉淀法、超濾法濃縮蛋白產(chǎn)物的純化辦法合用范疇凝膠過濾相對(duì)分子質(zhì)量差別大的雜質(zhì)沉淀法溶解度差別大離子交換色譜電荷差別大疏水色譜疏水性強(qiáng)親和色譜對(duì)配體的親和力差別大細(xì)胞內(nèi)可溶性體現(xiàn)產(chǎn)物親和色譜分離：運(yùn)用特異性的親和配基離子交換色譜：電荷差別大的雜質(zhì)細(xì)胞周質(zhì)體現(xiàn)蛋白低濃度溶菌酶解決，滲入壓裂解法。7.5基因工程藥品的質(zhì)量控制醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量確保的普通性要點(diǎn)產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)產(chǎn)品本身的構(gòu)造嚴(yán)格控制條件生物材料的質(zhì)量控制目的基因體現(xiàn)載體宿主細(xì)胞培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)原始種子批：確證克隆基因DNA序列，具體敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存于復(fù)蘇時(shí)宿主載體體現(xiàn)系統(tǒng)的