肝細胞肝癌中的血管生成擬態(tài)

肝細胞肝癌中的血管生成擬態(tài)

血管生成異常（mv）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種血液供應方式。腫瘤組織通過血管生成可與宿主血管相連通從而獲得足夠的血液供應而呈進行性生長、浸潤和轉移。血管生成擬態(tài)的特點是:腫瘤細胞模仿機體血管形成圍成管道樣結構,管道內(nèi)沒有血管內(nèi)皮細胞襯覆,血液在這種無內(nèi)皮細胞的管道中流動。血管生成擬態(tài)完全不同于人們所熟悉的內(nèi)皮依賴性血管,它的存在對以往只是針對內(nèi)皮依賴性血管進行抗血管形成治療從而抑制腫瘤生長的研究提出了挑戰(zhàn)。到目前為止,人們對于血管生成擬態(tài)的研究局限于高度惡性的雙向分化腫瘤,對上皮來源的惡性腫瘤很少涉及。肝癌最多見為肝細胞性肝癌(簡稱肝癌),手術切除雖是療效最好的方法,但肝癌根治性切除后5年復發(fā)率仍較高,肝癌總體預后差主要與肝癌富有血管并有較強的侵襲性有關。本研究通過構建肝癌細胞HepG2的三維培養(yǎng)模型以及在人肝癌石蠟標本中利用免疫組織化學和組織化學雙重染色技術觀察肝癌中是否存在血管生成擬態(tài)。1材料和方法1.1細胞庫和fbs肝癌細胞株為HepG2,購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫;10%FBS為杭州四季青產(chǎn)品;倒置顯微鏡(CK40)為日本Olympus公司產(chǎn)品。1.2細胞培養(yǎng)液/培養(yǎng)基三維細胞培養(yǎng)模型構建:自制鼠尾膠原,取直徑35mm玻璃培養(yǎng)皿一個(消毒前放入一張18mm×18mm蓋玻片),加入25!l鼠尾膠原,室溫下4~5min待膠原凝固后,加入3!l含有1×106個HepG2細胞的完全培養(yǎng)液(RPMI-1640+10%FBS),再加入2ml的完全培養(yǎng)液,放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日更換培養(yǎng)液,共培養(yǎng)7天。1.3edwdson分級收集2001~2006年間蘭州大學病理研究所15例肝穿刺活檢及手術切除的肝癌石蠟包埋標本。男性9例,女性6例;年齡35~70歲;Edmondson病理分級Ⅰ級2例,Ⅱ級4例,Ⅲ級7例,Ⅳ級2例。小鼠抗人CD31單克隆抗體(即用型,進口分裝),兔抗人Ferritin多克隆抗體(即用型,進口分裝),均購自福州邁新生物技術公司;免疫組化即用型二步法試劑盒,DAB顯色試劑盒,為北京中杉生物技術公司產(chǎn)品。1.4schiff染色免疫組化采用二步法:切片常規(guī)脫蠟水化;3%H2O2去離子水孵育10min;對進行CD31免疫組織化學染色的切片進行抗原修復;加入一抗4℃過夜;滴加試劑1,37℃孵育20min;滴加試劑2,37℃孵育30min;DAB顯色。PAS復染:顯微鏡下觀察,待CD31陽性的內(nèi)皮細胞著色后,水流沖洗1min終止顯色反應;將切片置于0.5%的過碘酸溶液中氧化15min;蒸餾水洗3min×2次后置于Schiff液中,避光環(huán)境下PAS反應15min;蒸餾水洗3次,每次1min,流水沖洗3min;蘇木精淺染細胞核5min,流水沖洗2min;分化,返藍,常規(guī)脫水,透明,樹膠封固。2結果2.1肺癌細胞培養(yǎng)的結構HepG2細胞接種后6h,細胞均貼附在膠原面上,肝癌細胞為多邊形,彼此之間呈鑲嵌樣生長,胞漿豐富,核圓形,居中,可見核仁,個別細胞可見雙核。48h以后,部分肝癌細胞伸出細長突起,彼此之間相互連接,形成環(huán)狀結構。培養(yǎng)第7天時細胞生長變慢,明顯可見肝癌細胞彼此連接形成網(wǎng)絡樣結構。用4%甲醛固定后進行PAS染色,可見大量的網(wǎng)絡樣,環(huán)狀PAS陽性圖案形成。見圖1。2.2免疫組織化學和組織化學雙重染色結果2.2.1pas雙重染色15例肝癌免疫組織化學染色可見血管內(nèi)皮CD31染色均為陽性,肝癌細胞Ferritin染色均為陽性。其中7例標本的CD31與PAS雙重染色可見由CD31陰性的腫瘤細胞圍成管道樣結構,管腔中可見紅細胞,一層PAS陽性物質(zhì)圍成基底膜樣結構將腫瘤細胞和紅細胞分開。Ferritin與PAS雙重染色亦可見Ferritin染色陽性,大而呈多邊形,胞漿充滿顆粒,核仁大,排列成不規(guī)則小梁狀的肝癌細胞圍成管道樣結構,一層PAS陽性物質(zhì)將腫瘤細胞同管腔分隔,腫瘤細胞構成的管腔結構中可見紅細胞存在。見圖2。2.2.2肝腫瘤的程度與血管生成的適應關系3血管生成擬態(tài)的發(fā)現(xiàn)與診斷腫瘤的生長分為兩個明顯的階段:無血管期(avascularstage)和血管期(vascularstage)。在無血管期,腫瘤生長主要靠周圍組織的彌散作用提供營養(yǎng),腫瘤生長緩慢,體積不超過2~3mm3;在血管期,毛細血管的生成使腫瘤能夠獲得足夠的營養(yǎng),腫瘤迅速生長并可以發(fā)生轉移。腫瘤轉移是多階段的級聯(lián)過程(cascadeprocess)。其主要步驟包括:原發(fā)癌生長;腫瘤血管生成;腫瘤細胞脫落并侵入基質(zhì);進入脈管系統(tǒng);癌栓形成;繼發(fā)癌生長;腫瘤血管生成;轉移癌的繼續(xù)擴散。從上述過程可以看出,腫瘤的血管生成對原發(fā)腫瘤的生長和增殖是必不可少的,同時對腫瘤的侵襲、轉移亦起著重要作用。1966年Warren等在研究移植于倉鼠夾囊中的人黑色素瘤血管形成模式和超微結構時發(fā)現(xiàn)了一種缺乏內(nèi)皮細胞的血液通道,但并未進一步研究,直到1999年Maniotis等在研究人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時進一步證實了這種血液通道的存在,并將其命名為血管生成擬態(tài)。到目前為止,炎性乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、骨肉瘤、以及一些雙向分化腫瘤:黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤,間皮肉瘤組織中也被證實存在血管生成擬態(tài)。在血管生成擬態(tài)發(fā)現(xiàn)之前,人們認為腫瘤中生成的血管都是內(nèi)皮依賴性血管,對抗腫瘤藥物的研究主要是抑制內(nèi)皮依賴性血管的生成,試圖通過這種途徑對腫瘤進行治療。近年來對血管生成擬態(tài)的研究多數(shù)局限于高度惡性的雙向分化腫瘤,肝癌是一種血供豐富,惡性程度高,預后很差的上皮來源惡性腫瘤。本文采用了三維細胞培養(yǎng)技術對肝癌細胞進行培養(yǎng),在傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)體系中,細胞離開了在體內(nèi)與細胞外基質(zhì)相互作用的整體環(huán)境,它們所表現(xiàn)出的生物學行為也必然與體內(nèi)有很大差異。本實驗采用的三維細胞培養(yǎng)技術,是將細胞放在膠原凝膠中生長,使它們在體外也能與細胞外基質(zhì)相互作用,表達其生物學特征。三維培養(yǎng)結果證實肝癌細胞可借助膠原支架生長,細胞伸出細長突起,彼此之間相互連接,形成環(huán)狀網(wǎng)絡狀結構,說明肝癌細胞具有自身變形能力,模仿內(nèi)皮細胞形成血管樣通道以適應腫瘤內(nèi)缺血缺氧的環(huán)境,為腫瘤的生長提供更為豐富的血供。肝癌組織中存在大量的肝血竇,在HE染色切片中肝血竇與血管生成擬態(tài)很難區(qū)分,本研究采用肝細胞的特異性標記物Ferritin對肝癌細胞進行標記,從而能夠觀察到圍成血管生成擬態(tài)的細胞是否為肝癌細胞。為了進一步證明肝癌中血管生成擬態(tài)的存在,對同一個石蠟標本進行連續(xù)切片,兩張連續(xù)切片分別進行CD31與PAS、Ferritin與PAS的免疫組化與組織化學雙重染色。CD31與PAS雙重染色顯示血管生成擬態(tài)結構中沒有內(nèi)皮細胞標記物CD31陽性細胞出現(xiàn),腫瘤細胞貼附在PAS陽性的基底膜樣結構外面,血管生成擬態(tài)管腔中有紅細胞存在,而管腔中紅細胞的存在證實了血管生成擬態(tài)是一種功能性血管。Ferritin免疫組化與PAS雙重染色證實圍成血管生成擬態(tài)的細胞為肝癌細胞。另外,本實驗還觀察到分化好的肝癌中血管生成擬態(tài)的形成少于分化差的肝癌;隨著分化程度的降低肝癌細胞逐漸出現(xiàn)CD31著色陽性傾向,說明肝癌細胞可能有表達內(nèi)皮細胞表型,模擬內(nèi)皮細胞功能的傾向。本研究由于病例數(shù)量較少,沒有對其做統(tǒng)計學分析。血管生成擬態(tài)的研究尚屬初步階段,國內(nèi)外學者對部分高度惡性腫瘤中是否存在血管生成擬態(tài)進行了初步的探索。本實驗通過細胞三維培養(yǎng)及免疫組織化學的研究證實了肝癌組織中確實存在這種特殊的血液供應方式,并初步發(fā)現(xiàn)肝癌中血管生成擬態(tài)的形成與其分化程度有一定的關系。肝癌因為其惡性程度高,預后差,術后復發(fā)率高,對它的治療一直沒有較好的方法,對血管生成擬態(tài)的分子機制的研究將可能為肝