基于型膠原鏈的兒童almae綜合征臨床及病理特點(diǎn)分析

基于型膠原鏈的兒童almae綜合征臨床及病理特點(diǎn)分析

as綜合征是一種由型膠原鏈突變引起的遺傳因素引起的異常或缺失引起的遺傳因素。臨床表現(xiàn)為血尿和（或）尿、神經(jīng)耳聾、視力異常和進(jìn)展性腎衰竭。電鏡下基底膜不規(guī)則增厚或變薄、分層、斷裂,是診斷AS的重要依據(jù)。該病主要有3種遺傳方式,最常見的是由COL4A5基因突變所致Ⅳ型膠原α5鏈表達(dá)異常或缺失的X連鎖顯性AS(X-linkeddominantinheritedAlportsyndrome,XLAS),約占80%~85%;編碼Ⅳ型膠原α3、α4鏈的COL4A3、COL4A4基因突變致相應(yīng)α鏈表達(dá)缺失導(dǎo)致常染色體隱性AS(autosomalrecessiveinheritedAlportsyndrome,ARAS)和顯性AS(autosomaldominantinheritedAlportsyndrome,ADAS),分別約占15.00%和5.00%。目前中國人群AS的報道主要是在東部地區(qū),西部地區(qū)AS的發(fā)病情況未見報道?，F(xiàn)對我院確診的20例AS患兒臨床及病理資料進(jìn)行回顧性分析,以探討中西部AS患兒的臨床及病理特點(diǎn)。1對象和方法1.1腎組織病理學(xué)特性收集我院2006年4月至2012年4月所有臨床病理診斷為AS患兒20例,其中男14例,女6例,所有患兒診斷均符合AS診斷標(biāo)準(zhǔn),均具有較完整的臨床及病理資料。正常對照:腎臟組織來自重復(fù)腎手術(shù)的部分組織,皮膚組織取自門診外科手術(shù)包皮組織。診斷標(biāo)準(zhǔn):符合以下4項中的3項:(1)臨床表現(xiàn)為血尿和(或)蛋白尿,及慢性腎衰竭家族史,或二者均有;(2)腎臟電鏡下典型的特征性改變?nèi)绮灰?guī)則增厚、變薄和分裂等;(3)腎臟或皮膚Ⅳ型膠原α鏈染色異常;(4)相關(guān)基因COL4A3/COL4A4/COL4A5突變。1.2方法1.2.1尿沉渣分析等包括患兒性別、起病年齡、臨床表現(xiàn)、家族史、實(shí)驗(yàn)室檢查(包括尿沉渣分析、24h尿蛋白定量、腎功能、眼底、純音聽力篩查等)。根據(jù)臨床首發(fā)癥狀將20例患兒進(jìn)行臨床類型的分型,分為3種類型:孤立性血尿、B孤立性蛋白尿、血尿+蛋白尿。1.2.2腎組織病理學(xué)檢測20例患兒均在局部或基礎(chǔ)麻醉下經(jīng)皮腎穿刺活檢,所得腎組織送南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科,標(biāo)本制成石蠟切片,進(jìn)行常規(guī)(光鏡+電鏡)病理診斷。部分石蠟切片4℃冰箱保存,備檢。1.2.3免疫熒光檢測方法腎組織石蠟切片(厚3μm),采用間接法行Ⅳ型膠原α5鏈免疫熒光染色。組織切片脫蠟至水,微波加熱抗原修復(fù);磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline,PBS)(0.01mol/L,pH=7.4)洗3次;滴加3%過氧化氫溶液(H2O2)室溫孵育10min,PBS洗3次;胃蛋白酶消化修復(fù),雙蒸餾水(doubledistilledwater,ddH2O)充分洗滌;10%山羊血清封閉10min,PBS洗3次;滴加一抗(Mab5),切片置濕盒,4℃冰箱孵育過夜;PBS洗3次;滴加二抗37℃孵育1h,PBS充分沖洗;甩干,甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。免疫熒光結(jié)果判斷:熒光顯示的部位,熒光染色半定量分析按-~++++分級。部分患兒皮膚組織或腎組織采用冰凍切片免疫熒光法檢測Ⅳ型膠原α1、α5鏈。將冰凍組織連續(xù)6μm厚切片,組織切片在空氣晾干后置冷丙酮中固定10min,PBS充分沖洗,加入一抗(Mab1、Mab5),室溫孵育2h,PBS充分洗滌后加入二抗室溫孵育1h(避光環(huán)境中進(jìn)行)。在抗α5(Ⅳ型)鏈單克隆抗體(Mab5)作用前,組織需經(jīng)6mol/L尿素(pH=3)[或6mol/L尿素、0.1mol/L甘氨酸緩沖液(pH=3.5)]室溫作用10min孵育以變性,暴露抗原結(jié)合位點(diǎn)(注:以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照,鼠抗人單克隆抗α1(Ⅳ)抗體作為陽性對照)。1.2.4小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測Ⅳ型膠原α1、α5鏈NC1區(qū)的鼠源性單克隆抗體(monoelontdantibody,Mab)Mab1和Mab5均購自瑞典Wieslab公司,異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體、胃蛋白酶、封閉用正常山羊血清原液購自北京中杉公司。1.3臨床表型與病理類型的發(fā)生率和影響因素采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)或中位數(shù)(M)表示。AS患兒不同性別起病年齡采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)(雙側(cè));多組樣本24h尿蛋白定量均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計的多個樣本比較的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)(單側(cè));是否伴腎間質(zhì)泡沫樣損害的患兒24h尿蛋白水平采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)(單側(cè));3種臨床表型與病理類型的發(fā)生率采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1入院時性別分布本組患兒男14例,女6例,男∶女=2.33∶1,男性平均起病年齡為7.15歲(1~13.5歲),女性平均起病年齡為5.18歲(1~10.25歲),不同性別的起病年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.045,P=0.310)。2.2as患兒年齡相關(guān)因素分析20例AS患兒按首發(fā)癥狀分為孤立性血尿(4例,20.00%)、孤立性蛋白尿(3例,15.00%)及血尿合并蛋白尿(13例,65.00%)3種臨床表型,鏡下血尿合并蛋白尿?yàn)樽畛Ｒ姷氖装l(fā)癥狀。4例孤立性血尿表現(xiàn)者腎功能均正常;有蛋白尿表現(xiàn)的16例患兒中,15例腎功能正常,1例腎功能不全(編號20),且出現(xiàn)蛋白尿的患兒其家族中尿毒癥患者的比例(6/16)較血尿表現(xiàn)者為高(1/4)。6例行眼底及聽力檢查,其中2例為雙側(cè)感音性神經(jīng)性耳聾。13例(65%)具有明確家族史,7例無明確家族史(表1)。分析不同臨床表現(xiàn)的AS患兒的起病年齡,發(fā)現(xiàn)以血尿?yàn)槭装l(fā)癥狀的患兒起病年齡較早,但由于孤立性血尿及蛋白尿病例數(shù)少,3者的起病年齡未做統(tǒng)計學(xué)分析。孤立蛋白尿組的24h尿蛋白水平明顯高于血尿合并蛋白尿組,2者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(H=11.959,P=0.003),見表2。2.3腎臟病理改變及型膠原5鏈分布特征2.3.1腎組織病理表現(xiàn)所有患兒均行腎活檢穿刺檢查,光鏡病理改變主要以輕中度系膜增生性腎小球腎炎(mesangialproliferativeglomerulonephritis,MsPGN)為多見(14例,70.00%),3例(15.00%)為局灶節(jié)段性腎小球硬化(focalsegmentalglomerulosclerosis,FSGS),2例(10.00%)為腎小球輕微病變(minimalchangesofglomerulus,MCD)及1例(5.00%)膜性腎病(membranousnephropathy,MN)。不同臨床表型的AS患兒其病理類型分布無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=4.149,P=0.900)(表3)。腎間質(zhì)泡沫樣改變的有12例,存在間質(zhì)細(xì)胞泡沫樣患者的尿蛋白水平明顯高于無間質(zhì)泡沫樣改變者(T=-2.083,P=0.039)(表4)。電鏡下17例患兒腎小球基底膜(glomerularbasementmembrane,GBM)均有不規(guī)則增厚或變薄、分層或撕裂等改變,其中1例并可見空網(wǎng)狀改變,3例無腎小球未行電鏡檢查。2.3.2患兒5鏈熒光染色結(jié)果18例行腎組織石蠟切片間接免疫熒光染色(表5),結(jié)果顯示:11例男性患兒GBM、包曼氏囊(Bowman’scapsule,BC)及腎小管基底膜(tubularbasementmembrane,TBM)上均陰性表達(dá)(圖1B),2例女性患兒為馬賽克間斷陽性表達(dá)(圖1C),提示這13例患兒α5鏈染色結(jié)果均符合XLAS遺傳方式;余5例患兒中,2例(編號3、7)患兒在BC呈連續(xù)陽性表達(dá),GBM上陰性表達(dá)(圖1D),2例(編號2、12)患兒GBM、BC及TBM上正常表達(dá)(圖1E),1例(編號16)無腎小球。2例(1男,1女)患兒行腎組織冰凍切片免疫熒光染色,結(jié)果顯示:男性患兒GBM、BC及TBM上均為陰性表達(dá)(圖2B),女性患兒GBM、BC為馬賽克間斷陽性表達(dá)(圖2C),提示這2例患兒也為XLAS。皮膚組織冰凍切片間接免疫熒光染色:在20例經(jīng)腎活檢確診AS患兒中,有2例患兒(1男,1女)同時行皮膚活檢檢測抗α5(Ⅳ型)鏈熒光染色在皮膚EBM表達(dá)。結(jié)果顯示,男性患兒腎臟GBM及皮膚EBM均為陰性表達(dá)(圖3B、圖3E);女性患兒GBM、EBM呈間斷陽性表達(dá)(圖3C、圖3F),同時檢測該患兒母親皮膚EBM抗α5(Ⅳ型)染色亦呈間斷不連續(xù)陽性表達(dá),證實(shí)這2例為α5(Ⅳ型)鏈表達(dá)異常導(dǎo)致的XLAS(表6)。3腎活檢光鏡檢測AS是一種在臨床上較常見的遺傳性腎臟疾病。AS遺傳呈異質(zhì)性,男女均可發(fā)病,男性多于女性。本組20例患兒中男女比例為2.33∶1,大多在10歲前發(fā)病,起病年齡無性別差異,與國內(nèi)文獻(xiàn)報道一致。AS的臨床表現(xiàn)多樣。本組資料顯示,AS首發(fā)癥狀可表現(xiàn)血尿(4例)、蛋白尿(3例)、血尿合并蛋白尿(13例),以血尿合并蛋白尿?yàn)槭装l(fā)癥狀多見,與Wang等報道一致,但與國外文獻(xiàn)報道的大多數(shù)AS患者首發(fā)癥狀為持續(xù)鏡下血尿不同,提示AS表現(xiàn)形式可能與不同種族、不同地區(qū)的有關(guān),對原因不明的蛋白尿表現(xiàn)者,仍要高度警惕AS的可能。以血尿?yàn)槭装l(fā)癥狀的患兒起病年齡較早,提示血尿是早期AS患兒腎臟GBM過濾功能障礙的標(biāo)志。血尿后期也可出現(xiàn)蛋白尿,且本資料顯示有蛋白尿的患兒其家族中尿毒癥患者的比例(6/16)較血尿表現(xiàn)者為高(1/4),提示蛋白尿的出現(xiàn)及其發(fā)展是腎功能不全的危險因素。除腎臟損害外,感音性神經(jīng)性耳聾及眼部病變等腎外表現(xiàn)在AS患者身上發(fā)現(xiàn)。病例中接受眼底及純音聽力檢查有6例患兒,其中2例(1男,1女)雙耳感音性神經(jīng)性耳聾,眼底檢查均無明顯異常。眼耳病變檢測率低于文獻(xiàn)所報道,可能與兒童早期無腎外表現(xiàn)、本組受檢病例數(shù)少有關(guān),提示眼耳病變不能作為診斷AS的必需條件,但需長期監(jiān)測患兒的眼耳病變情況。本組病例腎活檢光鏡下病理無特異性改變,主要以系膜增生性MsPGN改變(14例,70.00%)為主,其次為FSGS(3例,15.00%),與何旭等報道一致。不同臨床表型的AS其病理類型的分布無顯著性差異,但以血尿?yàn)槭装l(fā)癥狀患者其相對應(yīng)的病理類型中無FSGS改變,而有蛋白尿表現(xiàn)者病理中FSGS改變有3例(18.75%),提示有蛋白尿的AS患兒的病理類型可能較血尿表現(xiàn)的患兒為重,蛋白尿的出現(xiàn)和進(jìn)展,是臨床進(jìn)行早期干預(yù)和治療提供重要的時機(jī)。本組患兒出現(xiàn)腎小管間質(zhì)細(xì)胞泡沫樣改變的有12例(60.00%),其尿蛋白水平明顯高于無改變者,與國外報道一致,提示大量蛋白尿可能加重了腎小管間質(zhì)損傷。雖然間質(zhì)泡沫性細(xì)胞亦在其他腎臟疾病如FSGS(36.5%)、MN(21.4%)亦有一定比例,但在AS的出現(xiàn)比例顯著增高,提示間質(zhì)泡沫性細(xì)胞可能為AS診斷的重要參考依據(jù)。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道根據(jù)腎臟和皮膚組織基底膜中Ⅳ型膠原不同α鏈的表達(dá),可以診斷XLAS患者和篩查XLAS基因攜帶者。XLAS的診斷主要依據(jù)GBM、BC、TBM及EBM上α5(Ⅳ型)鏈表達(dá)陰性,XLAS基因攜帶者根據(jù)EBM上α5(Ⅳ型)鏈呈間斷陽性表達(dá)。本研究根據(jù)其腎臟GBM、BC及TBM上Ⅳ型膠原α5鏈特殊熒光染色分布特點(diǎn),作出遺傳方式判斷。其中符合XLAS遺傳方式有15例,抗α5(Ⅳ)鏈染色的AS診斷敏感性達(dá)75.00%。另2例根據(jù)α5鏈染色在BC陽性、GBM陰性表達(dá),而在文獻(xiàn)報道檢測皮膚EBM陽性表達(dá),推測可能為缺失所致常染色體遺傳型AS,有待檢測α3(Ⅳ型)和(或)α4(Ⅳ型)鏈進(jìn)一步明確。文獻(xiàn)報道檢測皮膚EBM上Ⅳ型膠原α5鏈以診斷XLAS,其敏感性為75%。本組病例同時行皮膚活檢的2例患兒中,皮膚抗α5(Ⅳ型)鏈染色異常,與腎臟檢測結(jié)果相一致。其中1例女性患兒母親行皮膚活檢,結(jié)果顯示其母皮膚EBM染色亦呈馬賽克間斷陽性表達(dá),這提示皮膚Ⅳ型膠原α5鏈檢測可成為遺傳咨詢的可靠依據(jù)和檢測手段。本組病例有1例(編號16,無家族史)皮膚EBM上抗α5(Ⅳ型)鏈免疫熒光染色正常,腎臟無腎小球未行檢測。有研究報道,大約20.00%AS患兒為常染色體遺傳型